【Abstract】 AIM: To study the effects of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) antibody on endothelin 1 (ET1) and nitric oxide (NO) in hepatic stellate cells (HSC). METHODS: Suspended liquid of cells at a density of 1×108/L was plated in culture dish under 37℃， 50 mL/L CO2 for 24 h， and pided into groups as follows (4 dishes in each group): control group; TGFβ1 antibody (5-20 mg/L) group， and continuously cultured for 24 h. The culture supernatant was collected. Nitric oxide synthase (NOS) activity was measured using colorimetry， NO level was determined by nitrate reductase technique， and ET1 content in the medium was surveyed by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) method. RESULTS: TGFβ1 antibody markedly inhibited HSC ET1 secretion in a doseeffect manner， and ET1 contents in control group， 10， 15 mg/L TGFβ1 antibody groups were （8.50±0.46）， （5.33±0.27） and （3.69±0.33） μg /L respectively， with significant difference in multiple comparison between different dosage groups (P&<0.05). Simultaneously， as TGFβ1 antibody dose increased， iNOS activity and NO synthesis increased， which in control group， 10， 15 mg/L TGFβ1 antibody groups were （1.94±0.16）， （3.29±0.42）， （3.88±0.32） ku/L and （46.75±4.72）， （80.68±5.44）， （88.58±2.84） μmol/L respectively. CONCLUSION: TGFβ1 antibody could decrease ET1 level and increase NO content in HSC.
【Keywords】 transforming growth factorβ1; hepatic stellate cells; endothelin; nitric oxide
【摘要】 目的: 研究转化生长因子β1 (TGFβ1)抗体对肝星状细胞（HSC）分泌一氧化氮（NO）和内皮素1（ET1）的影响. 方法: HSC以1×108/L的密度接种于细胞培养皿中，37℃，50 mL/L CO2条件下培养24 ｈ进行以下分组实验，每组重复4个培养皿：① HSC空白对照组；② HSC+TGFβ1抗体. TGFβ1抗体为5~20 mg/L，继续培养24 ｈ. 取培养上清液，用硝酸还原酶法测定NO水平，化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性，酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法检测ET1含量. 结果: TGFβ1抗体能明显抑制HSC分泌ET1，且随着抗体剂量的增加ET1含量降低，对照组、10，15 mg/L TGFβ1抗体组分别为（8.50±0.46），（5.33±0.27）， （3.69±0.33）μg /L，且各剂量组之间两两比较差异均有统计学意义(P&<0.05)；随着TGFβ1抗体剂量加大，iNOS活性和NO的合成增加，对照组，10，15 mg/L TGFβ1抗体组分别为（1.94±0.16），（3.29±0.42），（3.88±0.32） ku/L和（46.75±4.72）， （80.68±5.44）， （88.58±2.84） μmol/L. 结论: TGFβ1抗体能降低HSC ET1水平，增加NO含量.
【关键词】 转化生长因子β1抗体；肝星状细胞；内皮素；一氧化氮
0引言
肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）活化不仅是肝纤维化的细胞学基础，而且活化HSC的收缩是门脉高压的细胞学基础. 目前认为，一氧化氮（NO）、内皮素1(ET1)是调节HSC收缩与舒张的重要因素［1］.HSC的活化是通过各种细胞因子经旁分泌或自分泌途径作用的结果，其中转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1， TGFβ1)是最关键的因子［2］. 因此，本研究试图应用TGFβ1抗体作用于体外培养的大鼠HSC，观察TGFβ1抗体对HSC分泌NO和ET的影响，探讨TGFβ1与其它细胞因子间的关系，从而为本病探索一条可能的治疗途径.
1材料和方法
1.1材料兔抗TGFβ1抗体(美国Santa Cruz Biotechnology， Inc)； RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；胰蛋白酶消化剂(美国Sigma公司)；NO测定试剂盒、NO合成酶(iNOS)测定试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(深圳晶美生物有限公司)；兔抗ET1多抗(北京中山生物技术公司).
1.2方法
1.2.1HSC的培养HSC株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSC，从CCl4诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性［3］. 将冷冻保存于液氮中的HSC复苏后接种于含10 mL/L胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液中， 37℃， 50 mL/L CO2条件下培养. 当细胞呈单层致密状时，2.5 g/L胰蛋白酶消化后传代.
1.2.2TGFβ1抗体处理HSC细胞同步化处理后进行以下分组，每组重复4个培养皿. ①HSC空白对照组；②HSC+TGFβ1抗体. TGFβ1抗体分别为5，10，15，20 mg/L，继续培养24 ｈ.
1.2.3NO水平、iNOS活性及ET1含量测定取培养上清液，采用硝酸还原酶法测定NO水平，化学比色法测定NOS活性，ELISA双抗体夹心法检测ET1含量，具体操作按试剂盒说明书进行.
统计学处理： 所有资料以x±s表示， 使用SPSS 11.5统计软件包， 多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)， 最小差值显著法(LSD)作多重比较.
2结果
2.1TGFβ1抗体对HSC ET1的影响对照组活化的HSC能分泌大量的ET1，TGFβ1抗体能明显抑制HSC分泌ET1，而且随着剂量的增加ET1含量降低. 不同剂量TGFβ1抗体处理的HSC，其ET1含量均低于对照组(P&<0.05)，且各剂量组之间两两比较差异均有统计学意义(表1).
表1TGFβ1抗体对肝星状细胞ET1，iNOS和NO的影响（略）
aP&<0.05 vs对照; bP&<0.05 vs 5 mg/L TGFβ1抗体； cP&<0.05 vs 10 mg/L TGFβ1抗体；dP&<0.05 vs 15 mg/L TGFβ1抗体.
2.2TGFβ1抗体对HSC iNOS，NO的影响体外培养的HSC能分泌一定量的NO，TGFβ1抗体增加HSC的iNOS活性，使NO的合成与分泌增加，不同剂量组与对照组比较差异均有统计学意义，随着TGFβ1抗体剂量加大，iNOS活性和NO的合成增加，但20 mg/L与15 mg/L TGFβ1抗体组比较差异无统计学意义(P&>0.05)，表明20 mg/L TGFβ1抗体达到增加HSC的iNOS活性和NO的合成最大效应(表1). 3讨论
肝纤维化的形成机制较为复杂，多种细胞因子对其发病起着重要作用，单一细胞因子并非孤立发挥作用，各种细胞因子通过自分泌和旁分泌彼此相互作用，形成细胞因子网络，共同调控肝纤维化的发生和发展. TGFβ1是有关纤维化的细胞因子网络中重要因子，与其它细胞因子有着广泛而复杂的联系.
近年来发现HSC的收缩与舒张在调节肝窦阻力及微循环中具有重要作用，与肝硬化门脉高压症的发生及发展密切相关. HSC的舒、缩功能受自主神经与血管活性介质的调节，目前备受关注的是ET和NO. ET是调节HSC收缩的一种最重要的活性物质［4］，激活的HSC是产生ET1的主要细胞. NO是Ｌ精氨酸在NOS的作用下生成的，HSC表达诱导型NO(iNOS)合成酶［5］，NO对HSC收缩和收缩蛋白产生有影响，能阻断ET引起的HSC收缩，有明显的舒张HSC作用. 有报道TGFβ1可刺激活化的HSC分泌ET1［6］，为此，本研究拟观察抗TGFβ1抗体阻抗TGFβ1作用后，HSC内 NO和ET1变化.
实验表明，活化的HSC能自分泌NO和ET，具有iNOS活性. TGFβ1抗体能抑制HSC分泌ET1，提示TGFβ1抗体可能通过抑制HSC分泌ET1，从而抑制其收缩，使肝内阻力降低. 相反， TGFβ1抗体能明显增加HSC iNOS活性，培养上清液NO水平增加. 这种情况下，推测一方面NO对HSC的舒张作用增强，另一方面，内源性NO阻断ET，引起HSC收缩的作用也减弱，其结果是肝内阻力及门静脉压力降低. 肝内的实际情况则涉及更加复杂的多细胞、多因子的参与.
TGFβ1在肝纤维化的形成过程中起着非常重要的作用，因此从细胞因子水平寻求有效的抗纤维化治疗药物，中断某些介质或因子对TGFβ1的初始合成，用细胞因子抗体阻断细胞因子的作用，拮抗TGFβ1作用成为治疗肝纤维化的新途径. 目前， 这些治疗方法仍然处于理论和体外实验、 动物实验阶段. 关于在人体及全身水平上细胞因子间相互作用及细胞因子网络对肝纤维化的影响， 有待做更深一步的研究.
参考文献
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