作者：任君琳 王涛 许彦鸣 孟艳玲 温伟红 张瑞 张巍 杨安钢
【关键词】 ScFv抗体；caspase
【Abstract】 AIM: To construct the recombinant expression vector of antiHER2 ScFv/FDT/caspase6 and investigate its proapoptosis activity after transfected into gastric cancer SGC7901 cells. METHODS: AntiHER2 ScFv (e23sFv) was attached to human recombinant caspase6 (RC6) gene by recombinant PCR， and the Furin recognition site of diphtheria toxin (FDT) served as the linker to construct e23sFvFDTRC6 recombinant gene. The recombinant gene was cloned into the vector pCMV， and the recombinant plasmid was transiently transfected into HER2 positive SGC7901 cells and HER2 negative HeLa cells via lipofectamine mediation. MTT assay was used to show how the cell living status was affected by the gene transfection. The proapoptotic activity of recombinant plasmid was detected by indirect immunofluorescent staining. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that e23sFvRC6 and e23sFvFDTRC6 genes had been cloned into vector pCMV. After transfection， the expression of fusion protein was found through Western Blot. MTT assays showed that the growth of SGC7901 cells was inhibited. Typical apoptotic changes of the SGC7901 cells transfected with pCMVe23sFvFDTRC6 were seen by indirect immunofluorescent staining. CONCLUSION: The expression of recombinant antiHER2 ScFv/FDT/caspase6 gene can induce the apoptosis of HER2 positive SGC7901 cells.
【Keywords】 ScFv antibody; caspase6; apoptosis
【摘要】 目的：构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase6 基因的表达载体，转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法：采用重组PCR法，将抗HER2的单链抗体（e23sFv）通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列（FDT）与人重构型caspase6（RC6）基因重组，构建融合蛋白表达基因e23sFvFDTRC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV，以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞. MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用. 结果：把e23sFvRC6，e23sFvFDTRC6基因克隆入真核表达载体pCMV，酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确. 转染SGC7901和HeLa细胞后，Western Blot检测到目的蛋白的表达. MTT实验观察到转染pCMVe23sFvFDTRC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制，间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFvFDTRC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变，部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论：重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.
【关键词】 ScFv抗体；caspase6基因；细胞凋亡
0引言
Caspase6是介导细胞凋亡的重要蛋白酶，其蛋白含有3个结构域：原结构域、大亚基和小亚基［1-3］. 大小亚基顺序进行重排的caspase6分子即Reversed caspase6 (RC6)具有天然caspase6的活性，且能在体外识别并切割PARP及Lamin A等底物［4-5］. HER2/neu是表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)受体家族成员之一，其表达量与肿瘤的恶性程度及预后相关. HER2是一种公认的肿瘤标志物，是抗肿瘤治疗的理想靶标［6-7］. 在我国，部分胃癌患者HER2特异性高表达. 我们将抗HER2的单链抗体（e23sFv）基因通过白喉毒素(Diphtheria toxin， DT)的Furin识别位点的编码序列（FDT）与人RC6基因重组，构建了融合蛋白表达基因e23sFvFDTRC6及不含Furin识别位点序列e23sFvRC6的真核表达载体，并将其瞬时转染SGC7901细胞和HeLa细胞，观察其表达产物对转染细胞生长的影响.
1材料和方法
1.1材料DH5α感受态细菌，质粒pCMVe23sFvPEⅡRC6，胃癌细胞系SGC7901，宫颈癌细胞系HeLa由本室保存；RPMI 1640，脂质体Lipofectamine2000TM及反转录试剂盒(Invitrogen公司)；兔抗人active caspase6多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗人Lamin A多克隆抗体(Cell Signaling公司)； HRP标记的山羊抗兔IgG，DAPI，羊抗兔Cy3(武汉博士德公司)；限制性核酸内切酶Hind Ⅲ，XbaⅠ， EcoRⅠ，NotⅠ，T4 DNA ligase(TaKaRa公司).
1.2方法
1.2.1引物设计与合成根据PCR引物设计原理，经计算机及网络辅助分析，设计上、下游引物w1，w2和w3，其中w1与w3配对能特异性扩增FDTRC6约880 bp的基因，w2与w3配对能特异性扩增RC6约850 bp的基因. 3条引物均由上海生工生物公司合成，序列如下：①w1：5′ TTT GCG GCC GCG AAA GCC GGC AAT AGA GTG AGG AGA TCT GTG GGC GCA GCC TCC GTT TAC 3′ ；②w2：5′ TTT GCG GCC GCG AAA GCA GCC TCC GTT TAC 3′；③w3：5′ TTT TCT AGA TTA ATC TAC TAC ATC CAA AGG AAT 3′.
1.2.2细胞转染将处于对数生长期的细胞，用2.5 g/L胰酶消化后，以5×105/孔接种于6孔板中，继续培养24 h. 待汇合率达到80%后，吸出培养液，用不含血清的RPMI 1640将细胞冲洗2遍. 取3 μg/孔的pCMV，pCMVe23sFvFDTRC6和pCMVe23sFvRC6分别溶于500 μL RPMI 1640培养液，称为A1，A2，A3液； 将3份6 μL/孔的 Lipofectamine2000TM分别溶于500 μL RPMI 1640培养液，室温孵育2 min，为B1，B2，B3液；将A1和B1，A2和B2，A3和B3两液分别混合， 室温孵育20 min，缓缓滴加至6孔板中，于37℃，50 mL/L CO2条件下培养8 h. 吸弃转染液，加入1 mL 含100 mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI 1640培养液，继续培养.
1.2.3Western Blot检测将已处理的蛋白样品进行SDSPAGE电泳，电压分别为浓缩胶80 V，分离胶为150 V；100 V 转移2 h至NC膜上；将NC膜浸在封闭液（50 g/L 脱脂奶粉溶于TBS）中，在室温下封闭1 h；加入以封闭液1∶300稀释的一抗，4 ℃过夜； 用TBST(10 mmol/L Tris・HCl， pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 1 mL/L Tween20)洗膜，5 min×3次；加入以封闭液1∶1000稀释HRP标记的二抗，室温下放置1 h；TBST洗膜，5 min×3次；加入发光液浸泡NC膜5 min；暗室内压片，显影，定影，显现目的条带后及时以自来水冲洗终止反应.
1.2.4MTT实验以1×104/孔将细胞接种于96孔板中，每个实验组设4个复孔. 继续培养24 h，取0.3 μg/孔的pCMV，pCMVe23sFvFDTRC6和pCMVe23sFvRC6分别溶于50 μL RPMI 1640培养液，称为A1，A2，A3液； 将3份0.8 μL/孔的Lipofectamine2000TM分别溶于50 μL RPMI 1640培养液，室温孵育2 min，为B1，B2，B3液；将A1和B1，A2和B2，A3和B3两液分别混合，室温孵育20 min，缓缓滴加至96孔板中，培养8h后吸弃转染液，加入200 μL 含100 mL/L小牛血清的无抗生素的RPMI 1640培养液，继续培养. 分别于转染后0，24 ，48，72，96 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL， 37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解. 在酶联免疫检测仪上测定各孔A490 nm值，以时间为横轴，A490 nm值为纵轴绘制细胞生长曲线.
1.2.5间接免疫荧光染色制备细胞爬片，经转染48 h后，以40 g/L多聚甲醛固定10 min，0.1 mL/L Triton X100处理10 min. 依次加入用10 g/L BSA 1∶500稀释的兔抗人Lamin A多克隆抗体、羊抗兔cy3和DAPI，以激光共聚焦显微镜观察并照相.
2结果
2.1重组抗HER2 ScFv/FDT/RC6质粒的构建以5 ng的质粒pCMVe23sFvPEⅡRC6为模板，用设计好的引物w1，w2，w3分别进行PCR扩增FDTRC6和RC6，以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，扩增出约880 bp和850 bp的片段，与预期理论值相符. 胶回收目的片段，另取1 μg的质粒pCMVe23sFvPEⅡRC6用NotⅠ， XbaⅠ双酶切，回收约6500 bp左右的载体片段，用T4 DNA ligase 连接两片段，连接产物转化、涂皿、过夜生长，挑取单克隆培养，质粒提取并以NotⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定，切出了880 bp和850 bp左右的片段. 经测序证实所构建的质粒正确，命名为pCMV e23sFvFDTRC6和pCMV e23sFvRC6（图1）.
2.2重组蛋白在SGC7901和HeLa细胞中的表达取新鲜接种的SGC7901和HeLa细胞，分别转染pCMV空载体，pCMVe23sFvRC6和pCMVe23sFvFDTRC6 36 h后，Western Blot检测细胞裂解液中目的蛋白的表达（一抗为兔抗人active caspase6抗体，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG）. 发现转染pCMVe23sFvRC6和pCMVe23sFvFDTRC6的SGC7901和HeLa细胞中均有目的蛋白的表达，分子质量约为6×104 ku（图2）.
图1重组质粒的酶切鉴定（略）
1：HeLa/ pCMV； 2：HeLa / pCMVe23sFvFDTRC6；3：HeLa /pCMVe23sFvRC6; 4：SGC7901/ pCMV；5：SGC7901/ pCMVe23sFvFDTRC6；6：SGC7901/pCMVe23sFvRC6.
图2转染后重组蛋白的检测（略）
2.3重组蛋白对转染细胞增殖的影响融合蛋白e23sFvRC6和e23sFvFDTRC6的表达对HER2阴性HeLa细胞生长无影响. e23sFvRC6融合蛋白的表达对HER2阳性SGC7901细胞的生长无影响，而e23sFvFDTRC6融合蛋白的表达可以明显抑制该细胞的生长(图3).
图3重组基因转染HeLa细胞和SGC7901细胞后MTT测定曲线（略）
2.4重组蛋白对SGC7901细胞形态结构的影响转染pCMVe23sFvFDTRC6质粒的SGC7901细胞中部分细胞出现核固缩、核膜破裂等凋亡特征. 而转染pCMV空载体和pCMVe23sFvRC6质粒的细胞核膜完整，细胞形态正常(图4).
图4转染后SGC7901细胞的间接免疫荧光染色×600（略）
3讨论
DT是分子质量为5.48×104 ku的外毒素，主要由毒性结构域A和受体结合的结合结构域B构成. A/B两个结构域之间有Furin的酶切位点连接. 毒素与受体结合后，经过胞吞作用内化入细胞形成内吞体，在内吞体内将AB切开，然后具有细胞毒作用的A结构域进入胞质，对细胞进行杀伤［8］. Furin对各种毒素的切割效率差别很大，其对于DT的切割效率要比对绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)高出1倍，且其切割不需要酸性环境［9-10］. Lamin蛋白是构成细胞核核膜的主要成分之一，它对于维持正常细胞的功能有着重要意义. Lamin A的切割可作为caspase6活性检测的标志.
本室已经构建的以HER2为靶向的免疫促凋亡分子是由肿瘤表面抗原HER2的特异性单链抗体、PE转膜结构域（253~364氨基酸）及促凋亡分子caspase6组成［11］. 我们用DT中Furin识别序列的10个氨基酸组成的短肽替换PE转膜结构域（253~364氨基酸），以pCMV空载体和不含Furin识别序列的RC6为阴性对照. 将构建的重组分子转染HER2阳性SGC7901胃癌细胞，Western Blot可以检测到转染36 h后目的蛋白的表达. MTT法测定并绘制生长曲线，可以观察到重组蛋白的分泌表达对于HER2阴性HeLa细胞的增殖没有明显影响. 对于HER2阳性SGC7901细胞，分泌表达的重组蛋白e23sFvFDTRC6可以靶向与SGC7901细胞结合并被内吞入细胞，在内吞体内Furin切割重组蛋白后免疫促凋亡分子RC6转位至细胞质，诱导细胞的凋亡. 而无Furin识别序列的融合蛋白e23sFvRC6则对细胞的生长增殖没有明显影响. 通过间接免疫荧光染色观察到表达e23sFvFDTRC6融合蛋白的细胞部分出现细胞核的固缩等典型的凋亡特征. 而对照组细胞形态及细胞核无明显变化，说明我们构建的 pCMVe23sFvFDTRC6具有促进HER2阳性SGC7901细胞凋亡的作用. 相对于pCMVe23sFvPEⅡRC6，pCMVe23sFvFDTRC6的转位结构域是由10个氨基酸组成，从而很大程度上降低了免疫促凋亡分子的分子质量及免疫原性，为今后的临床应用提供了实验依据.
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