作者：李佩珍，张恩勇，潘若望，黄大道，应俊，张洪勤，曾兴业
【摘要】 目的?：了解温州地区汉族人群瘦素受体(LEPR)Pro1019Pro基因型分布，探讨该基因多态性与高血压合并肥胖的关系。方法：运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定无亲缘关系的381例温州地区汉族人群的LEPR基因Pro1019Pro多态性(正常对照组111例，高血压病合并肥胖148例，高血压病非肥胖122例)。结果：高血压合并肥胖组LEPR基因Pro1019Pro的AA、GA和GG基因型表达频率分别为0.770、0.196和0.034，等位基因G和A频率分别为0.132和0.868;高血压合并非肥胖组基因型表达频率分别为0.590、0.352和0.058，基因型G和A等位基因频率分别为0.234和0.766;正常对照组基因型表达频率分别为0.514、0.405和0.081，G和A等位基因频率分别为0.284和0.716;Pro1019Pro位点多态性的分布频率在对照组和病例组间差异有显著性(P?&<0.05)，且A等位基因频率在高血压合并肥胖患者中显著高于非肥胖组(P?&<0.05)。结论：LEPR基因Pro1019Pro多态性与温州地区汉族人群高血压合并肥胖相关。
【关键词】 瘦素受体;基因多态性;高血压;肥胖;温州地区;汉族
Abstract: ? Objective: To understand the genotype distribution of Pro1019Pro in Han population in Wenzhou area，and discuss its relation of hypertension patients to obesity. Methods:?The genotypes of Pro1019Pro variant in leptin receptor gene were determined with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms?(PCR-RFLP)?assay in 381 unrelated subjects of Wenzhou Han population，including 111 normal subjects?(the control group)，148 cases of hypertension patients with obesity and 122 cases of hypertension patients without obesity. Results:?The expressive frequencies of AA， GA and GG genotypes of pro1019pro in hypertension with obesity were 0.770， 0.196 and 0.034，?respectively. The frequencies of G and A allele were 0.132 and 0.868 in patients of hypertension with obesity. The expressive frequencies of genotypes in patients of hypertension without obesity were 0.590， 0.352 and 0.058. The frequencies of G and A allele were 0.234 and 0.766 in patients of hypertension without obesity. The expressive frequencies of genotypes in control group were 0.514，0.405 and 0.081. The frequencies of G and A allele were 0.284 and 0.716 in control group，respectively. The genotype frequency of Pro1019Pro variant in leptin receptor gene in the control group and the case group had a significant difference?(x2=10.639，P?&<0.05). The A allele frequencies also showed significant difference between the patients of hypertension with obesity and the patients of hypertension without obesity?(x2=9.492，P?&<0.05) and was significantly higher in the patients of hypertension with obesity than those in patients of hypertension without obesity. Conclusion:?These data indicates that Pro1019Pro variation in leptin receptor gene are possibly associated with hypertension complicated with obesity in Han population in Wenzhou area.
Key words: ?leptin receptor;gene polymorphisms;hypertension;obesity;Wenzhou;Han people
近年来随着我国经济的发展，人们的生活水平不断提高，肥胖的发病率迅速增加，肥胖合并高血压更是常见。温州地区流行病学研究表明温州已是高血压的高发地区，人群健康受到巨大威胁[1]。为进一步明确病因，我们对肥胖合并高血压患者进行了基因检测，探讨瘦素受体(LEPR)基因变异与温州地区汉族人群肥胖合并高血压的关系。
1??资料和方法
1.1??一般资料??270例高血压患者选自2006年9月-2008年3月期间温州医学院附属第一医院、解放军118医院等的住院患者，均符合我国2002年修订的高血压临床标准，收缩压&>140 mmHg，舒张压&> 90 mmHg，排除合并严重肝、肾疾病、恶性肿瘤及其他系统疾病。将其设为高血压组，其中男142例，女128例，平均年龄(59.0±5.3)岁。以体重指数(BMI)≥25 kg/m2为切割点将其分为高血压合并肥胖组148例，其中男76例，女72例，平均年龄(60.5±6.2)岁，BMI(29.2 ±1.9)kg/m2;高血压非肥胖组122例，其中男66例，女56例，平均年龄(58.1±7.0)岁，BMI(21.0±1.2)kg/m2。正常对照组111例，均为健康体检者，男53例，女58例，平均年龄(56.4±7.2)岁，BMI(20.5±2.3)kg/m2，肝肾功能正常，血糖正常。
1.2??方法??用5% Chelex-100快速提取法[2]提取模板DNA，利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行LEPR基因Pro1019Pro多态性分析：以0.2μg DNA为模板在反应体积为30μL内进行PCR扩增，引物分别为上游5’-ACTGTGGTCTCT CTACTTTC-3’，下游为5’-CCATGAGCTATTAGAGAA AGAATCCGTCAA-3’(上海捷瑞公司合成)。PCR产物长度为276 bp，经1%琼脂糖电泳确认扩增结果后，以限制性内切酶Hinc?II(TaKaRa Taq TM公司)在37 ℃条件下酶切PCR物2.0 h，用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物片段，硝酸银染色后观察结果。
1.3??统计学处理方法??以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，运用基因计数法计算各组基因频率及等位基因频率。
2??结果
高血压组和对照组BMI、血压的差异有显著性(P?&<0.05)，见表1。年龄、性别差异无显著性。
2.1??LEPR Pro1019Pro多态性??电泳结果显示共有三种类型，分别为：GG型纯合子有两个酶切位点，可被切成173 bp、75 bp两条带;AA型纯合子只有一个酶切位点，被切成201 bp 、75 bp两条带;GA型杂合子则有201 bp、173 bp和75 bp三条带(见图1)。381例温州地区汉族人群中AA、AG及GG基因频率分别为0.638、0.307和0.055;等位基因A和G的分布频率为0.791和0.209，基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。
2.2??高血压组和对照组各基因型及等位基因频率比较??Pro1019Pro基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，在对照组和高血压组间差异有显著性(P?&<0.05)，且A等位基因频率在高血压合并肥胖患者中显著高于非肥胖组(P?&<0.05)。见表2。
3??讨论
LEPR基因属细胞因子超家族，于1995年被定位克隆[3]，它定位于人类染色体1p31，长约511 kb，含20个外显子，19个内含子，包括2个细胞因子motif和Box1、Box2、Box3的一致顺序，编码1?165个氨基酸。其基因产物为leptin受体，主要分布在下丘脑，与脂肪组织分泌的leptin结合，通过信号传导途径调节机体能量代谢[4]。对于高血压与LEPR基因变异的关系，动物实验研究表明向动物脑室内注射瘦素后可使其循环系统内儿茶酚胺分泌增加，还可增加动物交感神经系统的输出，提高平均动脉压，说明瘦素参与了血压的正常调节[5];在db/db小鼠中发现LEPR基因突变引起LEPR基因RNA剪接异常，导致产生异常的LEPR造成肥胖[6]。
本实验选取了LEPR基因的第20外显子，研究Pro1019Pro基因多态性与温州地区高血压合并肥胖的关系。结果表明，LEPR基因Pro1019Pro位点多态性的分布频率在对照组和病例组间差异有显著性，提示A等位基因可能与温州地区高血压病发生有关;为进一步分析LEPR基因变异是否与高血压合并肥胖有关，进行高血压亚组比较，发现A等位基因频率在高血压合并肥胖患者中显著高于非肥胖组，说明A等位基因可能是温州地区高血压合并肥胖的易感因素。此研究与刘红英等[7]报道一致，其可能机制为：①虽然该同义突变不引起氨基酸表型的改变，但却可影响蛋白的表达丰度，致使LEPR表达的量异常，从而导致瘦素的生理作用减弱。②LEPR基因发生突变后其转录产物可能出现异常拼接，产生一种异常的LEPRmRNA，经翻译生成较短的leptin受体 ，虽可以同leptin结合，但不能将信号传至胞内发挥调节作用。但关于LEPR基因Pro1019Pro多态性在高血压病合并肥胖的发生、发展过程中产生的作用还有待于进一步的研究证实。
高血压病合并肥胖的发生是基因和环境因素共同作用的结果[8-9]，两者在高血压病的发生和发展过程中均发挥着不可或缺的作用，LEPR基因多态性类型将可能对该病发生、发展趋势判断、诊断、治疗(包括基因治疗)提供新的思路。我们认为要切断导致基因变异相关环境危险因素得从基因水平进行探讨，有助于临床防治工作。
参考文献
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