槲皮素对非酒精性脂肪肝细胞ATP结合框转运子A1 mRNA表达的影响

【摘要】 目的： 探讨植物化学物质槲皮素(quercetin)对非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)细胞三磷腺苷结合框转运子A1(ABCA1)表达的影响。方法： 建立人肝L02细胞脂肪变性模型，以不同浓度的槲皮素处理细胞后，用RTPCR检测ABCA1 mRNA的表达。结果： 槲皮素可以增加NAFL细胞ABCA1 mRNA的表达，且呈剂量依赖性。结论： 槲皮素能上调胆固醇转运中的重要蛋白ABCA1的表达。

【关键词】 槲皮素; 非酒精性脂肪肝; 人肝L02细胞; 三磷腺苷结合框转运子A1

　　[Abstract] Objective: To study the effects of quercetin on the expression of ATPbindingcassette transporter A1(ABCA1) mRNA in nonalcoholic fatty liver(NAFL) cells. Methods： HL02 cells were cultured in 50% fetal cattle blood serum for 24 h to induce NAFL model， adding quercetin in different doses to the culture medium.The level of ABCA1 mRNA was tested by semiquantitative RTPCR. Results： After treatment with quercetin，the expression of ABCA1 was increased at the same time. Conclusion： Quercetin had some inhibitory effects on NAFL cells and the effect on these cells was mainly related to the upregulation of ABCA1.

　　[Key words] quercetin; nonalcoholic fatty liver; HL02 cells; ATPbindingcassette transporter A1

　　非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)病理学改变除三酰甘油(TG) 大量储积外，尚有胆固醇(TC)在肝细胞内的异常沉积。ABCA1 是ATP 结合框转运子(ATPbindingcassette transporter，ABC) 超家族的成员。研究表明，ABCA1 在胆固醇逆转运(RCT)、固醇代谢中起着极其重要的调节作用。近来从中草药和天然植物中提取的一些有效成分，已成为治疗该类疾病的热点和新途径。除公认的抗氧化剂普罗布考等西药外，植物提取成分——槲皮素(quercetin)也正获得越来越多的关注。我们前期的试验证明，槲皮素能降低脂肪变人肝L02细胞总胆固醇及胆固醇酯含量，增加游离胆固醇的外流，下调胆固醇合成的限速酶HMGCoA还原酶的表达[1]。本实验旨在进一步研究槲皮素对体外培养肝细胞胆固醇外流的作用及其相关机制，为治疗胆固醇代谢性疾病开辟新途径。

　　1 材料和方法

　　1 主要材料

　　人肝L02细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。槲皮素、四甲基偶氮唑盐(MTT)、胎牛血清购于美国Sigma公司，RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。总RNA提取试剂盒(Trizol)为上海生物工程公司产品。其余试剂均为国产分析纯。ABCA1和GAPDH引物均由上海生物工程公司合成。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 人肝L02细胞培养及NAFL模型的建立 人肝L02细胞培养接种于50 ml培养瓶中，将含体积分数10%的灭活胎牛血清、100 U/ml氨苄西林和100 μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基，置37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养，每48 h换液1次，在细胞达1×109时用完全培养基重新悬浮，并以1∶3的比例传代，取对数生长期细胞进行实验。实验前用无血清的 RPMI1640培养24 h，使细胞周期同步化。参照范建高等[2]方法，在更换新鲜培养液后加入50%的胎牛血清，继续培养24 h，即形成非酒精性肝脂肪变性模型(镜像比较造模前后细胞内的脂滴变化，组织学上低倍镜下每单位面积见1/3以上的肝细胞脂肪变性和脂肪储积，无其他明显组织学改变)。加入槲皮素共同孵育24 h。

　　1.2.2 实验分组 实验分为正常肝细胞组(培养24 h+24 h)，NAFL模型组(造模24 h+24 h)、小剂量组(造模24 h后，加槲皮素使其终浓度为10 μmol/L，共同孵育24 h)、中剂量组(造模24 h后，加槲皮素使其终浓度为20 μmol/L，共同孵育24 h)、大剂量组(造模24 h后，加槲皮素使其终浓度分别为40，80 μmol/L，共同孵育24 h)、普罗布考对照组(造模24 h后，加普罗布考使其终浓度为10 μmol/L，共同孵育24 h)。实验重复5次，结果取平均值。

　　1.2.3 ABCA1 mRNA的RTPCR检测 收集培养的细胞，按Trizol试剂的说明书，分别提取总RNA，用紫外分光光度计定量后，调整RNA的浓度为0.2 g/L。RTPCR的反应体系为：两对引物各1.0 μl，10×缓冲液 5 μl，25 mmol/L MgSO4 1 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 0.5 μl，DNA聚合酶0.5 ml及逆转录酶0.5 μl，用去离子水补至25 μl。反应条件为：48℃ 45 min， 94℃ 3 min;94℃ 90 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共28个循环后，再于72℃延伸7 min。取RTPCR产物5 μl，在10 g/L含溴乙啶的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯下观察结果。RTPCR引物序列参照文献设计如下：ABCA1 上游引物5′GGGAGGCTCCCGGAGTT3′，下游引物5′GTATAAAAGAAGCCTCCGAGCATC3′，PCR扩增产物长度为1352 bp;GAPDH引物序列设计如下:上游引物5′TCACCATCTTCCAGGAGCGAG3′，下游引物5′TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3′， PCR扩增产物长度为697 bp。

　　1.2.4 统计学分析 实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用q检验，P&<0.05为差异有统计学意义。全部资料均用SPSS12.0统计软件进行分析。

　　2 结 果

　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，在697 bp处均可见到均匀一致的GAPDH基因的条带;各组在1 352 bp处均可见到ABCA1表达，正常组肝细胞弱表达，模型组细胞表达明显更弱(图1)。不同浓度槲皮素处理后，其表达呈浓度依赖性增强，其中槲皮素20，40，80 μmol/L组与模型组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)，见图2。

　　3 讨 论

　　某些蛋白质可以参与肝细胞中的游离胆固醇胞内移动及出胞，理论上亦可影响胆道胆固醇分泌。长期以来人们都认为胆固醇的转运依赖于磷酸脂的转运而非蛋白质介导，但实际上对磷酸脂和胆固醇的协同尚不十分肯定。尽管到目前为止没有一个胆固醇转运蛋白被确定下来，但是很可能存在一种蛋白质介导的胆固醇转运。ABCA1 是ATP 结合框转运子超家族的成员，存在于不同的组织，尤其在肝脏表达较多，通过水解ATP 转运许多底物到不同的部位。由于发现ABCA1 基因变异与丹吉尔病(TD)、家族性HDL 缺乏(family HDL deficiency，FHD) 的发生密切相关[3]，所以ABCA1 的结构、功能、表达调控目前受到极大的关注。研究表明[4]，ABCA1 在胆固醇逆转运(RCT)、固醇代谢中起着极其重要的调节作用。ABCA1的主要功能是参与胆固醇逆转运，即将外周组织过多的胆固醇转移至肝脏代谢的过程。ABCA1可将外周组织细胞内的胆固醇和磷脂转运至HDL前体apoA1，而这是胆固醇逆转运的第一个限速环节， 因此ABCA1对脂质代谢具有重要影响。临床研究证实[5]ABCA1基因突变可导致TD和家族性低α脂蛋白血症(FFA)， 均表现为低高密度脂蛋白胆固醇血症和早发冠心病。ABCA1基因的外周组织细胞过度表达可促进胆固醇和磷脂的外流，增加血浆胆固醇、胆固醇脂等的浓度。胆固醇逆转运可阻止胆固醇积聚，是防止高胆固醇血症的机制之一。Repa 等于2000年报道[6]：增加ABCA1的功能不仅可使巨噬细胞中胆固醇外流增加，提高胆固醇逆转运，而且可使肠黏膜细胞中的胆固醇分泌增加，胆固醇吸收减少，认为这也许是一条新的降低血浆胆固醇的途径。

　　槲皮素[3，3′4′，5，7-五羟基黄酮]是天然黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中。许多研究已证实槲皮素有抗增殖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药理作用，亦能抗肝纤维化，抑制肝癌细胞的生长，而且毒副作用小，具有重要的临床价值[7]。其药理活性广泛、安全、而且药源充足，极具开发前景。我们的研究认为，槲皮素降低肝细胞中的胆固醇，促进胆固醇和磷脂的外流作用可能通过多靶点、多途径，增强脂肪代谢相关调控因子的表达或活性，促进胆固醇和磷脂的外流、阻止胆固醇积聚[1]。本实验经不同浓度的槲皮素处理脂肪变性肝细胞24 h，结果显示：槲皮素呈浓度依赖性地增加ABCA1 mRNA的表达。由此可以推测：槲皮素降低胆固醇作用机制之一可能是上调胆固醇转运的重要蛋白ABCA1等的表达，且其作用效果呈现一定的剂量依赖性。这为今后进一步的研究提供了理论依据。

参考文献

　　[1] 张 洁，阳学风，廖端芳，等.槲皮素对脂肪变性L02细胞胆固醇合成及羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶表达的影响[J].中华肝脏病杂志，2007，15(2):143-145.

　　[2] 范建高，曾民德.脂肪性肝病[M].上海:上海医科大学出版社， 2000:153.

　　[3] 郭志刚，查 政，刘亚洋，等.HDL合成的关键基因——ABCA1基因的变异及其临床意义[J].解放军医学杂志，2006，31(4)：363-365.

　　[4] Favari E， Zanotti I， Zimetti F，et al. Probucol inhibits ABCA1mediated cellular lipid efflux[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(12):2345-2350.

　　[5] Vaisman BL，Lambert G，Amar M，et al. ABCA1 over expression leads to hyperalphalipoproteinemia and increased biliary cholesterd excretion in transgenimic mice[J].J Clin Invest，2001，108(2):303-309.

　　[6] Repa JJ，Turley SD，Lobaccaro JA， et al.Regulation of absorption and ABClmediated efflux of cholesterol by RXR beterodimers[J].Science，2000，289(5484):1524-1529.

　　[7] 王艳芳，王新华，朱宇同. 槲皮素药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2003，15(2)：171-173.