西地那非对在体兔肺缺血再灌注损伤的影响

【摘要】 　　目的：利用兔在体肺移植模型，探讨磷酸二酯酶抑制剂西地那非对兔肺缺血再灌注损伤的影响及其可能机制。方法： 健康家兔20只，随机分为LPD组与西地那非组，每组10只，分别以LPD液和加入0.7 mg/L的西地那非的LPD液进行肺动脉灌洗和保存，每组分别于缺血前、再灌注后1，2 h取左下肺静脉血行血气分析，检测静脉血氧分压（PvO2）；于缺血前、再灌注0.5，1，1.5，2 h取左下肺静脉血，测超氧化物歧化酶（SOD）活性、诱导型氧化亚氮合酶（iNOS）活性；于再灌注2 h时取肺组织，测丙二醛（MDA）含量、髓过氧化物酶(MPO)活性；检测肺组织湿/干比(W/D)；在光镜、透射电镜下观察肺组织形态结构变化。结果： 两组动物再灌注后各时点PvO2均较缺血前下降，但西地那非组明显好于LPD组；再灌注后西地那非组SOD表达高于LPD组；再灌注后西地那非组MDA、iNOS、MPO表达明显低于LPD 液组；肺组织湿/干比西地那非组明显低于LPD 液组；西地那非组组织结构损伤变化较LPD组轻。结论： 西地那非有较强的抗氧化能力，能够提高机体清除氧自由基能力；有一定的抗炎能力，能减弱炎症反应。西地那非作为肺保护液添加剂对肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

【关键词】 西地那非； 肺缺血再灌注损伤； 兔； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 髓过氧化物酶

　　［Abstract］Objective: To investigate the effects of sildenafil on insitu lung ischemiareperfusion injury in rabbits. Methods： Twenty rabbits were randomly pided into two groups. In LPD group，the lungs were perfused and preserved with LPD solution;in sildenafil group， they were with LPD+sildenafil solution which add sildenafil 0.7 mg/L into LPD solution. Before ischemia， 1 h and 2 h after reperfusion，PvO2 were analysed for blood from left inferior pulmonary vein. Before ischemia，0.5，1，1.5 and 2 h after reperfusion superoxide dismutase(SOD) activity and iNOS activity were analysed for blood from left inferior pulmonary vein， 2 h after reperfusion malondialdehyde(MDA) level and myeloperoxidase(MPO) activity from lungs tissue were checked. At the end of the operation got the lung tissue for lung wet/dry weight ratio and biopsy. Results： At the same time，the PvO2 was higher in the sildenafil group than that in the LPD group.The SOD activity were higher in the sildenafil group than that in the LPD group，while the MDA level，iNOS and MPO activity were lower in the sildenafil group than that in LPD group. The wet/dry weight ratio was significantly lower in sildenafil group than that in LPD group. The morphologic and ultrastructural damages in sildenafil group were less than in LPD group. Conclusion： Sildenafil can eliminate oxygen free radicals with its strong antioxidation mechanism and can attenuates inflammation reaction with its antiinflammation mechanism，resulting in alleviating lung reperfusion injury of pulmonary grafts. The sildenafil had positive effect on preservative quality of the insitu lung transplantation model in rabbits.

　　［Key words］sildenafil; lung ischemiareperfusion injury; rabbits; superoxide dismutase; malondialdehyde; myeloperoxidase

　　肺移植、心肺移植手术等，均可引起肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury，LIRI)，可造成术后早期肺功能不全，这是造成肺移植患者术后死亡的重要原因。肺移植及心肺移植术中对供体肺进行良好的肺保护，有利于术后肺功能的恢复。供肺保护的研究主要包括膨肺时气体成分、低温保护肺灌洗方法及肺保护液成分的研究。在这一领域中，尚有大量的工作需要进一步的探讨。本实验利用兔在体肺再灌注模型，对比研究LPD液与LPD液+西地那非(Sildenafil)对肺缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨西地那非对肺缺血再灌注损伤起保护作用的可能机制。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 动物分组
　　
　　健康家兔20只，雌雄不限，体质量2 500～3 000 g，由江苏大学实验动物中心提供，随机分为LPD组和西地那非组，每组10只，分别以LPD液和加入西地那非的LPD液进行肺动脉灌洗和保存。LPD液配制成分为：Na+ 141 mmol/L， K+6.4 mmol/L， Cl-119 mmol/L， Mg2+5 mmol/L，葡萄糖10 g/L，低分子右旋糖酐10 g/L，胰岛素20 U/L。西地那非组在LPD液中加入西地那非0.7 mg/L。
　　
　　1.2 主要仪器与材料
　　
　　动物人工呼吸机DH140（浙江医科大学动物实验仪器厂）；多功能心电监护仪，多道生理信号采集处理器（四川生理仪器厂）；血气分析仪（美国IL公司GEMpremier 3000）；MDA，MPO，SOD，iNOS测试盒（南京建成生物公司）；柠檬酸西地那非注射液（纯度98%，西安高维制药公司）。
　　
　　1.3 在体肺保护模型的建立
　　
　　以盐酸氯胺酮30 mg/kg静推麻醉，术中根据动物反应用氯胺酮静推维持，每次用量10 mg/kg。麻醉生效后气管切开置入3.5 F气管插管接呼吸机控制通气（频率40 次/min，吸呼比1∶1，氧浓度21%，潮气量15 ml/kg）。掀开胸壁，显露左侧胸腔内器官。自耳缘静脉注入肝素3 mg/kg 全身肝素化。切除左上肺；显露左肺下叶，剪断左肺韧带，游离左肺门组织并套管待阻断（左肺动脉除外）；剪开心包组织，显露心房，经主肺动脉分支左右肺动脉处过线套管待阻断，经左下肺静脉左心房连接部的左房壁置管入左下肺静脉；从主肺动脉直接置肺动脉灌注管至左肺动脉，阻断左肺动脉；在左肺中度通气状态下收紧肺门线，阻断除左肺动脉外的肺门组织，降低潮气量至10 ml/kg。两组均自灌注管灌入4℃肺保护液，经左肺下静脉内穿刺管引流肺灌注液。肺灌注以重力为动力，垂直高度为60 cm，灌注总量60 ml/kg；灌注完毕后将肺放入低温肺保存器内，肺保存器接通冰水循环降温至10℃并维持。维持上述通气1 h，移去肺保存器，松开肺门及左肺动脉再灌注2 h，术中自股动脉置管，监测生命体征。
　　
　　1.4 标本采集
　　
　　（1）在缺血前、再灌注1，2 h取左下肺静脉血作血气分析，记录静脉血氧分压（PvO2）；（2）于缺血前、再灌注0.5，1，1.5，2 h取左下肺静脉血，3500 r/min离心10 min，取上清液，按羟胺法测超氧化物歧化酶（SOD）活性、按比色操作法测诱导型氧化亚氮合酶（iNOS）活性；（3）于再灌注2 h时取0.1 g肺组织，洗去血液后，制成5%的组织匀浆，用TBA法测丙二醛（MDA）含量，在匀浆中加入相应试剂后产生显色反应，再在分光光度计上于460 nm处测光密度计算髓过氧化物酶(MPO)活性；（4）切取标本：手术结束前取左肺组织2块，1 块(0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm 大小)用10%甲醛固定，切片，HE染色，光镜观察肺组织结构变化。另1块(0. 2 cm×0. 2 cm×0.2 cm 大小)用戊二醛、锇酸固定，树脂包埋，制作超薄切片，透射电镜观察组织超微结构变化；（5）取左肺相同部位组织约0.5 g，称湿重，在70℃下烘48 h称其干重，计算肺湿/干比，检测肺水肿情况。
　　
　　1.5 统计学处理
　　
　　计量资料以 ±s 表示，组间比较采用两样本均数t检验，组内比较采用方差分析，运用SPSS11.5统计软件分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 不同保护液对肺PvO2的影响
　　
　　两组动物各时点PvO2值，缺血再灌注前差别无统计学意义，再灌注1，2h时均低于缺血前，但西地那非组明显高于同时点LPD组（表1）。表1 再灌注前后肺PvO2 mmHg，Tab 1 The PvO2（mmHg）before and after reperfusion（略）。
　
　　2.2 不同保护液对血SOD，iNOS，肺组织MDA，MPO值以及湿/干比的影响
　　
　　缺血前两组家兔血浆SOD(U/ml)，iNOS(U/L)值差别无统计学意义。再灌注后各时点iNOS值高于缺血前值，但西地那非组明显低于同时点LPD组；再灌注后各时点SOD值低于缺血前值，但西地那非组均高于同时点LPD组(表2)。再灌注后西地那非组肺组织MPO活性、MDA值低于LPD组(P&<0.05)；再灌注后肺组织湿/干比值西地那非组低于LPD组(P&<0.05)(表3)。表2 灌注前后肺静脉血SOD，iNOS值，Tab 2 Value of SOD，iNOS from pulmonary vein blood before and after reperfusion（略）；表3 再灌注2 h后肺组织MDA、MPO值及湿/干比，Tab 3 Value of MDA，MPO，and W/D ratio from lung　tissue 2 h after reperfusion（略）。
　　
　　2.3 缺血再灌注后肺组织形态学变化
　　
　　光镜下观察，LPD组可见部分肺泡萎陷，肺间质水肿，肺泡间隔有较多炎性细胞浸润，微血管扩张，血管内皮细胞水肿。西地那非组肺泡结构尚清晰，肺泡壁结构尚完整，局部肺泡上皮细胞轻度肿胀，血管内皮细胞结构保持完整，肺间质内可见少许炎性细胞浸润，小血管扩张充血。见图1。电镜下观察，西地那非组大部分肺泡组织结构正常，Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞大致正常，部分肺泡上皮细胞水肿脱落。表面绒毛尚可见，板层小体亦较多见，肺泡腔基本通畅，但少数肺泡腔内有红细胞渗出，部分区域毛细血管内红细胞堆积，可见到少量的炎性细胞浸润。见图2。

　　LPD组肺泡间隔内毛细血管淤血明显，血管扩张，肺泡腔内红细胞漏出明显，成堆分布，伴纤维素渗出，可见中性粒细胞浸润，伴少量单核细胞，Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞及胞质内的板层小体排空，部分上皮细胞自溶，见图3a，有的肺泡上皮水肿、脱落致肺泡壁变薄、断裂，见图3b。
　　
　　3 讨论
　　
　　西地那非(Sildenafil)是一种环磷酸鸟苷(cGMP)特异的5型磷酸二酯酶(PDEV)高选择抑制剂［1］。PDEV是主要在肺动脉血管中表达的磷酸二酯酶，抑制该酶能够提高肺动脉和肺小动脉的血管平滑肌细胞内cGMP的含量，使其含量维持在较高水平，提高氧化亚氮在肺组织中的含量，改变细胞内外钙的转运，从而使平滑肌细胞松弛和血管舒张，进而降低肺动脉压力［2］。而cGMP有调控其他组织保护的中枢作用［3］，故人们将其用于对缺血再灌注器官模型的研究，并发现西地那非可减轻多种组织的缺血再灌注损伤［4-5］。本研究结果显示肺组织湿/干比值，西地那非组低于LPD组，说明西地那非能够减轻肺水肿，减轻肺缺血再灌注损伤。

　　肺移植术后早期的肺缺血再灌注损伤是患者术后发生肺功能不全导致死亡的重要原因［6］。自由基大量生成是LIRI的重要环节之一，有效清除自由基能够减轻移植肺LIRI。超氧化物歧化酶(SOD)是机体的内源性抗氧化剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，因而SOD活性水平的高低能间接反映机体清除自由基的能力［7］。膜脂质降解产生的主要代谢产物丙二醛（MDA）是常用来反映脂质过氧化的一个指标，测试其含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［8］。本研究结果显示，两组再灌注后各时点SOD值低于缺血前值，但西地那非组均高于LPD组；肺组织MDA，西地那非组明显低于LPD 液组，提示西地那非可以明显增加SOD含量，降低MDA含量，证明其可有效清除氧自由基，抑制脂质过氧化物的产生，保护肺血管内皮细胞，减轻肺缺血再灌注损伤。
　　
　　中性粒细胞(PMN)大量浸润引起的过度炎症反应也是LIRI发生的重要机制之一 ［9］。PMN被激活后在肺内大量聚集，释放多种因子从而损伤肺血管内皮细胞是导致LIRI的关键因素［10］。实验表明，对照组肺组织有大量的PMN浸润聚集，而西地那非组PMN浸润聚集较少。MPO是PMN胞质中的一种特异性酶，肺组织中MPO活性的变化可反映再灌注后PMN在肺组织的聚集程度和炎症反应程度。本研究显示西地那非组再灌注后其肺组织中MPO活性明显降低，提示西地那非可能通过抑制PMN在肺内聚集，稳定溶酶体膜，减轻炎症反应，从而减轻LIRI；氧化亚氮(NO)是内皮细胞重要的保护性物质，可升高细胞内cGMP，降低细胞内钙浓度。一般认为NOS是生成NO的关键、唯一的限速酶，有神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)三种异构体［11］，肺内主要是eNOS和iNOS。在生理情况下只有eNOS处于转录、翻译和催化NO合成的状态［12］。iNOS在炎症、创伤、缺血等情况下表达增强［13］。iNOS激活后催化产生的NO量大，比eNOS强数千倍，且酶活力持续时间较长，参与细胞损伤、炎症反应和细胞凋亡。Liu等［14］研究发现，缺血再灌注后iNOS表达激活增强，炎症源性NO合成大量增加，抑制iNOS表达可减轻炎症反应。本实验研究发现西地那非组相比LPD组缺血再灌注后各时点iNOS表达明显降低，说明西地那非可能通过有效抑制iNOS表达，减少炎症性NO的合成，抑制其LIRI细胞毒性作用，从而减轻炎症反应，保护移植肺功能。
　　
　　总之西地那非对兔在体肺移植模型有明显的肺保护作用。其机制可能是西地那非可提高机体氧自由基清除能力，减轻氧自由基的损伤；抑制中性粒细胞的激活，抑制iNOS表达，减少炎症性NO的合成。但其具体机制仍尚待进一步研究，实际效用有待临床应用来进一步检验。

参考文献

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