原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较

　　　　 作者：田雨香 许逊 蔺昕 陈勋 宗扬勇 招倩倩 季宝菊 王胜军 许化溪 邵启祥

【摘要】 　　目的： 评价HIV1 TAT蛋白转导结构域(PTD)携带的不同分子质量融合蛋白的穿细胞膜能力。方法： 诱导表达、纯化含PTDeGFP的不同分子质量的融合蛋白，与细胞共育后，通过流式细胞术、激光共聚焦评价融合蛋白穿膜能力。结果： 诱导表达、纯化获得3种含PTDeGFP的不同分子质量的融合蛋白。流式细胞术和激光共聚焦方法分析发现3种融合蛋白均具有高效穿膜能力。结论： PTD介导融合蛋白的穿膜能力与分子质量无直接关系。

【关键词】 蛋白转导结构域； 穿膜效率； 增强型绿色荧光蛋白； 分子质量

　　［Abstract］Objective: To judge the efficacy of the fusion protein including protein transduction domain of HIV TAT by multibiotechnology and to obtain the more effective cellular uptake protein for the further research of its biofunction.Methods： The expression of three fusion proteins were induced by IPTG and were purified from the inclusion bodies. Flow cytometry analysis and confocal microscope observation were used to evaluate the efficacy of the fusion proteins to transduce into the Jurkat cells， when the cells were exposed to fusion protein. Results： The fusion proteins could transduce into Jurkat T cells efficiently. Conclusion： All the three fusion proteins could cross the cell membrane and had no difference.

　　［Key words］protein transduction domain; the efficacy of transmembrane; prokaryotic expression； green fluorescence protein

　　1988年Green和Frankel分别发现HIV1 TAT蛋白能够穿过细胞膜［1，2］，随后的研究发现，TAT蛋白中的47～57(YGRKKRRQRRR) 位氨基酸才是真正具有转导作用的区域，被称为蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)［3］。该区域能转导自身及与其融合的多肽、蛋白及DNA分子进入几乎所有组织和细胞，甚至血脑脊液屏障，转导效率高且对细胞无明显的损伤［4-6］。PTD的发现，在研究蛋白功能和治疗方面有重要作用。绿色荧光蛋白(green fluorescence protein， GFP)相对分子质量为27 ku，在395 nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光［7］，它的表达没有种属特异性，而且产生的荧光不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之动物体内不产生内源性GFP，因此成为活细胞理想的标记物［8］。增强型绿色荧光蛋白(eGFP) 是GFP的突变体，在480 nm波长的激发光下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光［9］，作为报告蛋白，已经广泛应用于基础实验研究。我们利用本实验室现有的PTDeGFP载体，构建同一个目的蛋白的全长和其不同结构域（即片段1和片段2）的表达质粒，在大肠埃希菌中表达，得到3种纯化的蛋白，研究PTDeGFP携带的3种不同分子质量融合蛋白的穿膜效率和能力。

　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　
　　pET28aPTDeGFP目的蛋白，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDeGFP片段2载体由我室构建［10］；工程菌E.Coli DH5α，Rosetta和Jurkat为本实验组保存。纯化树脂Profinity Ni2+IMAC金属螯合填料（美国BioRad公司 ），蛋白标准参照购自Fermentas公司，鼠抗6×HisTag单克隆抗体(Cell Signaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒、PD10脱盐预装柱(美国GE公司)，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG Dioxane Free）（Merck公司，德国），小牛血清（杭州四季青公司），Bradford蛋白定量试剂盒为北京普利莱公司产品，PRMI 1640培养基（Invitrogen公司），24孔细胞培养板和细胞冻存管等购自Costa公司，RPMI1640细胞培养基购自Hyclone公司。
　　
　　1.2 仪器
　　
　　尼康(Nikon)全光谱共聚焦显微镜C1Si，流式细胞仪FACSCaliber（美国BD公司）。
　　
　　1.3 方法

　　1.3.1 3种融合蛋白的诱导表达及纯化 。

　　将我室构建的pET28aPTDeGFP载体［10］上分别插入目的基因及其片段，测序正确的质粒pET28aPTDeGFP目的基因，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDeGFP片段2分别转化大肠埃希菌Rosetta，筛选出阳性克隆，平板上挑单个菌落至3 ml LB 培养基（含50 μg/ml卡那霉素3 μl），37℃摇床培养过夜后以1∶100稀释后，将菌液接种于200 ml LB培养基，37℃增菌培养至D(600 nm)=0.4～0.6时加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG，于30℃诱导8 h。4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，1/10体积的预冷PBS重悬细菌，加入100 μg/ml的溶菌酶，冰浴，300 W超声12 s，间隔15 s，共8个循环超声裂解细菌。4℃ 12 000 r/min离心20 min，其沉淀作SDSPAGE电泳分析。用6×HisTag Ni2+IMAC对融合蛋白进行纯化（按BioRad公司操作说明书进行），即在pH8.0环境中用50 mmol/L Nah3PO4、300 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素结合缓冲液溶解包涵体，50 mmol/L Nah3PO4，300 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素洗涤缓冲液去除杂蛋白，然后再用50 mmol/L Nah3PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑、8 mol/L尿素洗脱液洗脱融合蛋白，最后用PD10脱盐柱脱盐。

　　1.3.2 细胞培养及穿膜能力的流式细胞仪检测 。

　　Jurkat T细胞常规培养于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L链霉素的RPMI1640培养液。以2×106/孔细胞浓度种于24孔板，与640 nmol/L的PTDeGFP目的蛋白、PTDeGFP片段1和PTDeGFP片段2三种蛋白分别共育4 h。1 000 r/min离心10 min，分别收集各孔细胞用PBS洗3次，FACSCaliber流式细胞仪检测。

　　1.3.3 激光共聚焦显微镜观测穿膜蛋白在细胞内的定位 。

　　1.5 ml EP管收集与蛋白共育的细胞（2×105个/管），1 000 r/min离心10 min。预冷PBS洗2遍，1 000 r/min离心，5 min。加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定液，缓缓悬起细胞，固定30 min。离心去固定液，用PBS洗2遍。加入PI染色液（终浓度50 μg/mL）缓缓悬起细胞，4℃避光染色30 min，PBS洗涤。加25 μl PBS重悬细胞并滴加至载玻片上，盖上洁净的盖玻片，指甲油封片。共聚焦显微镜下使用绿色滤光片检测呈红色荧光的细胞核，使用蓝色滤光片检测融合蛋白中eGFP绿色荧光。

　　2 结果
　　
　　2.1 3种融合蛋白的表达、纯化。
　　
　　将含重组质粒pET28aPTDeGFP目的基因，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTD eGFP片段2分别转导入E.coli Rosetta，以终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导8 h，经SDSPAGE电泳分析，发现蛋白条带分别位于80 ku，70 ku，61 ku处，与预期相符(图1)。目的蛋白主要以包涵体形式存在。使用Histag纯化柱Ni2+IMAC在变性条件下对融合蛋白进行纯化（图1），3种融合蛋白通过PD10脱盐柱脱去尿素及盐。
　　
　　2.2 3种融合蛋白穿膜能力的流式细胞仪分析。
　　
　　640 nm的3种融合蛋白分别与Jurkat T细胞共育4 h，收集细胞，经流式细胞仪检测，结果显示：约60%的Jurkat T细胞中有融合蛋白穿入（图2）。

　　2.3 激光共聚焦显微镜对比3种PTDeGFP融合蛋白穿膜能力。
　　
　　激光共聚焦显微镜下观察发现：与3种融合蛋白共育的Jurkat T细胞约60%有蛋白穿入，并且融合蛋白除可在细胞质发现外，在细胞核中亦有分布（图3a）；细胞在未加入蛋白的情况下，用PI染色（显示胞核）的荧光分布见图3b；同时应用PI染色，并加入蛋白时叠加的情形如图3c。分别加入PTDeGFP目的蛋白，PTDeGFP片段1和PTD eGFP片段2的情况也与前者相似(图3d～f)。
　　
　　(a)1，2为收集全菌的PTDeGFP目的蛋白；3，4，5为纯化的PTDeGFP目的蛋白；(b)1为收集全菌的PTDeGFP片段1；2为纯化的PTDeGFP片段1；3为纯化的PTDeGFP片段2；4为收集全菌的PTDeGFP片段2；M为标准参照物。

　　3 讨论
　　
　　近年的研究表明，PTD可以携带较大的生物分子进入各种细胞，具有速度快，效率高，不依赖于能量和温度且对细胞无毒性等优点［5］。目前认为，TAT的PTD的蛋白转导过程和蛋白转导结构域中的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸残基)有关，这些氨基酸均带有强的正电荷，可能通过直接与带负电荷的细胞膜脂类相互作用而介导穿膜过程［11，12］。Silhol等［13］发现，带有eGFP的PTD融合蛋白可通过吸附介导的胞吞机制进入细胞内。尽管关于PTD的融合蛋白有许多报道，有研究表明PTD可以携带分子质量大于110 ku的蛋白，但是对于不同分子质量和不同结构的分子是否具有相同的结果并没有报道。本研究通过同一种蛋白的全长、片段1（含有富含脯氨酸的结构）和片段2（含有叉头状结构）分析PTD融合蛋白的穿膜能力和效率，结果发现没有明显差别，而且流式细胞仪检测和共聚焦显微镜下的结果是一致的，说明PTD携带的蛋白穿膜能力（相对分子质量在一定范围内）与分子质量大小和结构关系不大。PTD融合蛋白的穿膜能力和效率常用流式细胞术检测，但由于涉及融合蛋白与细胞共育后再检测，纯化的蛋白如复性后不稳定会导致聚集黏附于细胞表面，造成流式细胞检测的穿膜假阳性结果［14］。这种假阳性结果，依据流式细胞术的散点图及直方图的图形无法正确判断，因此本研究还采用了共聚焦显微镜来观察确认其穿膜能力。此外也可以通过胞质和胞核蛋白的免疫印迹鉴定。因而联合应用两种或三种方法来检测穿膜蛋白的内化，可以有效避免假阳性结果。本研究证明PTDeGFP载体携带的目的蛋白及其两个片段，可以有效地穿膜，并定位在细胞核内，为进一步研究其生物学功能打下了基础。

参考文献

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