骨髓间充质干细胞复合音猬因子/纳米晶胶原基骨修复骨缺损

　　　　作者：史坚强 孙广友，马鹏， 徐成振　钱栋　徐晓峰

【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells）复合音猬因子（sonic hedgehog，Shh）修饰的纳米晶胶原基骨(nano Hydroxyapatite/collagen， nHAC)修复大鼠股骨缺损的效果。方法： SD大鼠 MSCs经成骨诱导后，种植于支架材料形成细胞支架复合物。SD大鼠30只制成股骨干5 mm节段性缺损，分为空白对照组：骨缺损处不植植入物，MSCs/nHAC组：植入MSCs/nHAC复合物，MSCs/ShhnHAC组：植入MSCs/ShhnHAC复合物。通过大体观察、X线放射学、组织学对比各组骨缺损修复情况。结果： SD大鼠MSCs在体外与nHAC，ShhnHAC复合培养第7天，电镜扫描证实ShhnHAC更有利于MSCs黏附、增殖。术后第6、12周放射学检查评价新骨生成各组间差异有统计学意义(P&<0.05)。术后组织学检查各组新骨生成速度、生成量差异有统计学意义(P&<0.05)。结论： MSCs/ShhnHAC复合物能够修复SD大鼠股骨缺损， 修复效果明显优于MSCs/nHAC复合物。

【关键词】 骨髓间充质干细胞; 纳米晶胶原基骨; 骨缺损; 音猬因子

　　［Abstract］ Objective: To explore the repair effect of the segmental bone defects in rats with nano Hydroxyapatite/collagen modified by bone marrow mesenchymal stem cells cocultured with sonic hedgehog(Shh）.Methods： MSCs obtained from SD rats bone marrow were induced and proliferated.After their osteoblastic phenotype had been demonstrated， MSCs were seeded onto the scaffolds.A bone defect(5 mm in length) was created in each rat and treated with three kinds of implantations.In blank control group， defect was filled with none; in MSCs/nHAC group with MSCs/nHAC compound; in MSCs/ShhnHAC group with MSCs/ShhnHAC compound.The repair effect of bone defect of every group was evaluated by general observation， radiographic examination and histologic analysis. Results： MSCs of SD rats were cocultured in vitro with nHAC， ShhnHAC separately for 7 days.The scanning through electron microscope confirmed that ShhnHAC was more conducive to adhesion and proliferation of MSCs.6 and 12 weeks after operation， radiology examination disclosed a significant difference of new bone formation between the groups(P&<0.05); histological examination disclosed a significant difference of new bone formation in rate and quantity between the groups(P&<0.05). Conclusion： The MSCs/ShhnHAC compound can repair the femoral bone defect of SD rats， and its effect of reparation surpassed the MSCs/nHAC compound obviously.

　　［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; nano Hydroxyapatite/ collagen; bone defects; sonic hedgehog　　严重创伤、炎症、肿瘤、先天性畸形等导致的节段性骨缺损是骨科医师面临的临床难题之一。利用组织工程技术构建组织工程骨治疗骨缺损是具有临床应用价值的治疗策略。骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨组织工程最重要的种子细胞，纳米晶胶原基骨(nano Hydroxyapatite /collagen， nHAC)已经作为人工合成生物支架材料替代骨缺损应用于临床［1］，研究表明其复合细胞后具有体内成骨能力［2］。

　　音猬因子（sonic hedgehog，Shh）具有促进造血前体细胞增殖的作用［3］。在牙胚发育过程中，Shh 与BMP、FGF 和Wnt 协同作用，调控牙齿的发育和萌出［4］。本实验以SD大鼠MSCs为种子细胞，以nHAC及ShhnHAC为支架材料体外共同培养，并采用构建的组织工程骨对SD大鼠股骨缺损进行修复，采用大体观察、X线、病理切片等指标评价修复效果，为骨缺损治疗中新型植入材料的选择提供实验依据。

1 材料和方法

　　1.1 动物和试剂

　　健康雄性SD大鼠35只，由江苏大学动物实验中心提供；纳米晶胶原基骨，由清华大学材料系提供；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；地塞米松、维生素C、β甘油磷酸钠、纤维蛋白原、Cy3标记的羊抗小鼠IgG，hoechst33342（Sigma公司）；小鼠抗大鼠I型胶原单克隆抗体(Santa Cruz公司)；Shh（PeproTech公司）。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 SD大鼠MSCs的获得、成骨诱导及传代 颈椎脱臼处死SD大鼠，无菌条件下取其股骨、胫骨， 用含体积分数10%胎牛血清的LDMEM 培养液冲洗骨髓腔冲出骨髓，淋巴细胞分离液分离后，置入含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C， 10 mmol/L β甘油磷酸钠的LDMEM培养基中，37℃，5% CO2 孵箱中培养，3～4 d后首次半量换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长分化情况。

　　待细胞融合成单层后（约长满瓶底90%），进行消化传代。用PBS液漂洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶2 ml， 37 ℃静置2～3 min，镜下观察到细胞收缩、间隙增大时，加入含10%胎牛血清的LDMEM 培养液中止消化，用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁细胞悬浮， 吸取细胞1 500 r/min离心5 min后，弃去上清液，加入成骨诱导剂吹打制成细胞悬液， 105/ml接种传代。

　　1.2.2 ShhnHAC的制备 Shh溶于LDMEM中（20 ng/ml），nHAC切割成 6 mm×5 mm×5 mm大小，置于ShhDMEM中，负压下真空抽吸，冻干24 h备用。

　　1.2.3 I型胶原免疫荧光染色 大鼠MSCs经诱导培养14 d后，固定细胞，PBS洗涤，0.25% TrixonX100 37℃水浴1 h，3%牛血清白蛋白封闭，加小鼠抗大鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体（1∶100），37℃水浴4 h，PBS洗涤，滴加Cy3红色荧光标记的羊抗小鼠IgG（1∶300），37℃水浴1 h，PBS洗涤，加hoechst33342，室温5 min，PBS洗涤，甘油封片，荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 构建组织工程骨 0.25%胰酶消化成骨诱导的MSCs，制成2×107/ml的细胞悬液，吸取100 μl分别滴加到已置入24孔板的ShhnHAC，nHAC材料表面，37℃， 5%CO2，饱和湿度静置2 h后，反转材料，向每组材料另一面滴加100 μl细胞悬液， 37℃， 5%CO2，饱和湿度静置培养2 h后，加上述成骨诱导培养液浸没材料，置于孵箱中培养。MSCs/nHAC，MSCs/ShhnHAC培养至第7天时，选取3个标本，10%的戊二醛固定， 再经1%四氧化锇固定，乙醇逐级脱水（50%，70%，90%，95%，100% 各 5 min），CO2临界点干燥或乙腈逐级处理。在真空干燥器内用水泵减压抽除乙腈溶剂，表面喷金后扫描电镜下观察细胞生长情况。

　　1.2.5 骨缺损模型制备与修复 取SD大鼠30只， 1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，剂量为1 ml/kg。麻醉生效后，取俯卧位，术野处剪毛消毒， 取下肢后外侧切口， 显露股骨， 按照长骨缺损临界值［5］用线锯造成股骨中段5 mm(包括骨膜)的骨缺损模型。将30只大鼠分为3组（每组10只）：空白对照组（骨缺损处不植植入物），MSCs/nHAC组（植入MSCs/nHAC复合物），MSCs/ShhnHAC组（植入MSCs/ShhnHAC复合物）。术后每天观察动物情况， 每天青霉素8万单位腹腔注射， 连续3 d，不做内外固定。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 大体观察 术后第6，12周腹腔麻醉下取各组5只SD大鼠行大体观察。

　　1.3.2 X线检查及放射学评分 术后第6，12周腹腔麻醉下行动物股骨正侧位X线片检查。X线片按LaneSandhu［6］评分标准评分。

　　1.3.3 组织学检查 术后第6，12周各组取5个标本经固定、包埋、HE染色、光镜观察骨缺损修复成骨情况。

　　1.4 统计学分析

　　采用SPSS11.5统计软件，多组间比较采用方差分析，数据以±s来表示， P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 倒置显微镜下MSCs生长情况

　　MSCs 24 h后部分贴壁，贴壁细胞呈圆形或椭圆形，少部分细胞悬浮。5 d左右细胞铺满瓶底，多为梭形，形态比较一致，呈鱼群样排列。10 d后细胞形态开始发生明显变化， 部分细胞由长梭形转变为立方形或多角形。

　　2.2 I型胶原免疫荧光染色结果

　　大鼠MSCs经成骨诱导培养14 d后， I型胶原免疫荧光染色阳性，红色荧光(Cy3)表示I型胶原在细胞内的分布，蓝色荧光(hoechst33342)为细胞核(图1)。

　　2.3 MSCs与nHAC，ShhnHAC复合培养情况

　　扫描电镜观察， MSCs复合到ShhnHAC支架后第7天，材料表面及孔隙内见大量细胞黏附增殖，胞质间相互融合，并有大量的细胞外基质分泌(图2a)。MSCs/nHAC培养至第7天，材料表面黏附的细胞较少，分泌的细胞外基质少见(图2b)。

　　2.4 实验动物一般情况及标本大体观察结果

　　各组大鼠术后约3 h清醒，术侧肢体活动欠佳。所有动物约7 d切口一期愈合， 无炎症及内植物排出。空白对照组始终不能自身修复，被脂肪、纤维组织填充。MSCs/nHAC组术后第6周时部分骨痂形成，缺损仍较明显；术后第12周时MSCs/nHAC大部分降解， 缺损较术前有所减小，但界线仍可辨认，骨折未完全愈合。MSCs/ShhnHAC组术后第6周时标本清晰可见， 材料与骨缺损的界面模糊，部分降解呈颗粒状；术后12周时材料与骨缺损的界面基本消失，骨缺损表面平滑、质地硬，表面有骨膜覆盖。

　　2.5 X线检查结果

　　空白对照组术后第6，12周时骨缺损均较明显。MSCs/nHAC组术后第6周时X线可见云雾状的新生骨痂，12周时缺损区可见大量骨痂，未见塑形。MSCs/ShhnHAC组术后第6周时X线见MSCs/ShhnHAC支架降解及少量骨组织形成，骨缺损处间隙模糊；12周时X线可见骨痂连续，骨髓腔通畅且新形成骨组织与已降解MSCs/ShhnHAC支架外形大体相似。骨缺损放射学评分结果见表1。表1 3组术后第6，12周骨缺损区放射学评分比较

　　2.6 组织学观察结果

　　空白对照组术后至第12周未见骨缺损获得骨性修复， 骨缺损处由纤维结缔组织填充。

　　MSCs/nHAC组术后第6周缺损区域周围有结缔组织长入， 两骨断端缺损区域有少量成骨细胞生长（图3a）。术后12周: 大多标本的材料未完全降解，与周围组织界线可辨认，植入区域有少量骨组织形成， 虽有血管长入， 但骨陷窝数目较少（图3b）。

　　MSCs/ShhnHAC组术后第6周移植物组织内微小血管增多， 内部孔隙可见类基质沉积， 含胞质丰富的成骨细胞，骨缺损部分区域出现比较成熟的骨组织结构，但支架材料与周围的骨组织界线清楚（图3c）。术后12周: 移植区域出现大量成熟骨结构， 骨皮质连续， 骨组织与周围组织分界不清， 缺损区域骨结构与正常骨结构大致相同， 骨皮质板层结构连续， 髓腔通畅（图3d）。

3 讨 论

　　创伤、感染、肿瘤等各种原因造成的骨缺损、骨不愈合一直是骨科治疗的难题之一，目前常用的治疗方式主要有自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植。自体骨移植修复骨缺损效果最好，缺点是骨源有限、取材不便，患者取骨处受到削弱，增加患者痛苦；异体骨存在排斥、吸收、不愈合可能等缺点；人工骨缺乏骨诱导成分，成骨能力较弱。骨组织工程学的兴起，为解决此类难题提供了可能性。目前对骨组织工程的研究主要集中在种子细胞、支架材料和骨组织构建等3个方面。

　　MSCs是目前是公认的骨组织工程理想的种子细胞，具有取材方便，增殖能力、成骨能力强，免疫原性弱等特点［7］，在目前骨组织工程中应用非常普遍。nHAC是基于仿生观念骨替代材料，有良好的生物降解性和骨传导性，具有与天然松质骨类似的三维结构。研究证实［8］，nHAC可作为骨缺损替代物和支架材料。黄永辉等［1］将nHAC应用于临床，证实其效果接近自体骨移植，达到自体骨移植的金标准，是一种理想的骨修复材料。马鹏等［9］用纤维蛋白修饰nHAC支架材料，发现纤维蛋白修饰后的nHAC支架材料能促进成骨定向诱导的MSCs黏附、增殖及分化。

　　Shh最初是在果蝇中发现的重要发育调控因子，特别对哺乳动物骨骼发育和重建调节起着关键作用，其信号的靶基因可能包括Ptc，wnt，Bmp，Msx等［4］。Warzecha等［10］用Shh诱导MSCs向软骨细胞分化中发现：Ⅱ，Ⅹ软骨胶原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）增加。Foppiano等［11］用Shh诱导MSCs向成牙细胞转化过程中发现：碱性磷酸酶(ALP)活性表达增加，成骨细胞表型阳性。Kinto等［12］研究发现，Shh可诱导成骨细胞分化和异位骨形成。上述研究表明Shh复合MSCs支架修复骨缺损是可行的。

　　本实验将SD大鼠MSCs分别与nHAC，ShhnHAC复合来构建组织工程骨，用于修复同种异体SD大鼠股骨缺损。结果显示： MSCsnHAC有一定骨修复能力，ShhnHAC支架材料较单纯的nHAC更有利于MSCs的黏附、增殖。植入的nHAC支架可逐步降解，未出现排斥反应和炎症反应，是较理想的支架材料；MSCs/ShhnHAC较MSCs/nHAC成骨较早且骨痂生成较多，能更快更有效地促进骨缺损的愈合，其成骨方式主要为软骨内成骨。这说明Shh可以促进成骨细胞的分化、增殖和骨骼的成形，MSCs/ShhnHAC复合物较MSCs/nHAC及nHAC有更好的促进修复作用，为研发新的高活性的骨科植入替代物提供了新的思路和方法。

参考文献

［1］ 黄永辉，沈铁城，徐晓峰.纳米羟基磷灰石/胶原骨在骨折后骨缺损中的应用［J］.江苏大学学报:医学版，2004， 14(4):292-294.

［2］ Zhu JZ，Miao ZN，Qian HG.Bone formation performance by autograft of rabbit mesenchymal stem cells cocultured with nano basal hydroxyapatite materials［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation， 2006， 10(41):195-197.

［3］ Kasten P，Vogel J， Luginbühl R，et al.Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier［J］.Biomaterials，2005，26(29):5879-5889.

［4］ 林 媛，吴补领，陆 群，等.Shh在大鼠牙胚发育过程中的表达［J］.临床口腔医学杂志，2004，20(4):203-204.

［5］ Bodde EW， Spauwen PH，Mikos AG， et al.Closing capacity of segmental radius defects in rabbits［J］.J Biomed Mater Res A，2008，85(1)：206-217.

［6］ Lane JM， Sandhu HS.Current approaches to experimental bone grafting ［J］.Orthop Clin North AM，1987， 18(2): 213-215.

［7］ 张晓玲，戴尅戎，汤亭亭，等.未分化骨髓间充质干细胞的免疫学特性研究［J］.中华实验外科杂志， 2006， 23(2):135 -137.

［8］ 孙 伟，李子荣，张 岚，等.纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养对表型影响［J］.中国误诊学杂志， 2006，16(8):1419-1421.

［9］ 马 鹏，徐成振，徐晓峰，等.表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响［J］.江苏大学学报：医学版，2008，18（4）:295-298.

［10］ Warzecha J，Gttig S， Brüning C，et al.Sonic hedgehog protein promotes proliferation and chondrogenic differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells in vitro［J］.J Orthop Sci，2006，11(5):491-496.

［11］ Foppiano S， Hu D， Marcucio RS，et al.Signaling by bone morphogenetic proteins directs formation of an ectodermal signaling center that regulates craniofacial development［J］.Dev Biol， 2007，312（1）:103-114.

［12］ Kinto N， Iwamotoc N， EnomotoIwamoto M， et al.Fibroblasts expressing Sonic hedgehog induce osteoblast differentiation and ectopic bone formation ［J］.FEBS Letters， 1997，404（2/3):319-323.