作者：陈志红， 钱海鑫， 秦磊， 周晓俊， 殷骏
【关键词】 肝移植； 大鼠； 动物模型
大鼠原位肝脏移植是肝脏移植研究中应用最广泛、最有价值的动物模型。我们采用“改良二套管法”对30对大鼠进行了大鼠原位肝移植手术（rat orthotopic liver transplantation， ROLT）。我们发现，大鼠的体质量、性别，精细的手术操作和管理以及缩短无肝期时间是决定大鼠原位肝移植成败以及术后长期生存的关键因素。现将大鼠原位肝移植动物模型成功建立的围术期管理过程报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及材料
健康雄性SD大鼠由苏州大学动物实验中心提供，共60只，体质量200～250 g，受体体质量略高于供体。供体术前禁食4 h，自由饮水，受体手术前12 h禁食，自由饮用糖盐水。显微手术器械一套。自制器械：门静脉袖套管内径为1.70 mm， 外径为1.94 mm，长3.0 mm；肝下下腔静脉袖套管内径为2.50 mm， 外径为2.75 mm，长3.0 mm；胆总管袖套管为小儿硬膜外导管，长4.0 mm。麻醉药品：氯胺酮（100 mg/2 ml）。供体肝脏灌注液：4℃乳酸钠林格氏液500 ml中加入肝素12 500 U制成。供体肝脏保存液：4℃乳酸钠林格氏液。受体肝脏驱血液：贺斯液。
1.2 实验方法
1.2.1 供体手术
供体采用氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉。取腹部肋缘下弧形切口，游离肝下下腔静脉，电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉。游离右侧肾动脉、右肾静脉。分离胆总管，在肝管汇合部远端约5.0 mm处插入胆总管插管并结扎固定。游离门静脉，贴近门静脉处用6-0线结扎幽门静脉。游离部分腹主动脉，用小儿细静脉留置针穿刺腹主动脉。迅速剪开膈肌，血管钳阻断胸主动脉。4℃供体肝脏灌注液持续灌注肝脏，流速控制在2～3 ml/min。经胸腔剪开肝上下腔静脉，平右肾静脉开口下缘剪断肝下下腔静脉。分离切断肝周韧带，贴膈肌环剪断下腔静脉。电灼离断肝与食管的血管支。均匀灌注肝脏至完全苍白，约需2～3 min，电凝后切断肝动脉，在脾静脉的水平剪断门静脉，在线结的远侧剪断幽门静脉，取出供肝。置入0～4℃乳酸钠林格氏液中。
1.2.2 修肝
修剪肝上下腔静脉和门静脉，在肝上下腔静脉两角用60手术缝线各缝合一针作为支持线，制作门静脉袖套管时，可将门静脉远端壁外翻于自制套管壁外，以幽门静脉的结扎线结刚好外翻于套管壁外为佳，60手术缝线结扎固定门静脉外翻壁。同法处理肝下下腔静脉。
1.2.3 受体手术
采用氯胺酮80 mg/kg腹腔注射麻醉。肋缘下弧形切口。游离肝下下腔静脉，电凝切断腰静脉、右肾上腺静脉。游离肝周韧带，电凝切断左膈静脉，充分游离肝上下腔静脉。电凝切断左肝至食管血管。游离胆总管，在分叉处切断。游离结扎切断肝固有动脉。在幽门静脉水平上方游离门静脉。用微血管夹阻断肝下下腔静脉、门静脉，无肝期计时。在门静脉分叉处穿刺，缓慢注入（1.0～1.5 min）37℃贺斯液2.5～3.5 ml驱血。用Satinsky钳钳夹膈肌环阻断肝上下腔静脉，以膈肌环刚好外露在钳下缘为好。近肝切断肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉，移去原肝。将供肝从4℃的保存液中取出，原位放入肝脏腔隙内。先吻合肝上下腔静脉，连续缝合腔静脉壁，缝合最后一针前用肝素化生理盐水冲洗血管腔排出气泡。冲洗受者门静脉断口内的血凝块，迅速套入供者门静脉袖套管并结扎固定。移去门静脉微血管夹及肝上下腔静脉Satinsky钳，供肝恢复血流，无肝期结束。微血管夹夹闭供肝肝下下腔静脉，受者肝下下腔静脉内的血凝块用肝素生理盐水冲洗后，迅速套入供肝下腔静脉袖套管，1号丝线结扎固定。大量40℃生理盐水冲洗供肝和腹腔复温。将胆总管支架管插入受者胆总管内并结扎固定，大网膜覆盖供肝胆总管，固定。拭尽腹腔内40℃复温液。滴两滴庆大霉素（4 万U/ml）于腹腔内及皮下。用1号丝线关腹。
1.2.4 术后处理
手术结束后，酌情从阴茎背静脉补液2～3 ml。将大鼠放置在电热台板上复温30 min并持续吸氧。完全清醒后单笼喂养，自由进糖盐水，自由进食。
2 结果
“改良二套管法”大鼠原位肝移植动物模型不同阶段手术时间：供体手术时间(24.73±2.02) min，修肝(9.47±1.55) min， 受体手术时间(43.50±3.20) min，冷缺血时间(43.51±8.13) min，无肝期(14.27±1.98) min，下腔静脉阻断时间(17.63±2.09) min。
“改良二套管法”大鼠原位肝移植动物模型手术成功率及7天生存率见表1（术后存活24 h视为手术成功，在不成功2例中，1例是由于肝上下腔静脉吻合口漏血，另1例是由于门静脉套管后漏血；术后存活7天及以上进入7天生存成功例数）。表1 大鼠肝移植手术成功率及7天生存率（略）
3 讨论
3.1 术前大鼠的选择
我们一般选用200～250 g成年雄性健康大鼠作为供、受体，受体一般比供体大20～30 g较为合适，过大或过小大鼠的耐受力均较差。大鼠过大时腹腔内有较多的脂肪组织，包绕在脏器、血管及胆道周围，过小的大鼠血管和胆道偏细，均不利于操作。
3.2 手术技术的改进
Kamada等［1］于1979年在大鼠原位肝脏移植术中应用套管法吻合门静脉，从而保证无肝期一般可控制在25 min以内。1983年Kamada等［2］进一步将肝下下腔静脉亦采用袖套法吻合，从而缩短了受体手术时间，进一步提高了存活率。本实验以经典的二套管法（Kamada法）作为大鼠原位肝脏移植基本手术方法，在此基础上进行了一些改进，完善了手术的每一细节，本组平均无肝期时间是（14.27±1.98）min，基本上避免了手术意外，结果获得93.3%的手术成功率和86.7%的7天生存率。现在把手术改进的要点和注意点介绍如下。
3.2.1 麻醉
我们采用氯胺酮腹腔注射麻醉，供体100 mg/kg，受体80 mg/kg［3］。在使用氯胺酮腹腔注射麻醉时采用宁少勿多，术中酌情补足的原则。
3.2.2 供肝的保护
在供体手术中以尽量不接触肝脏为原则，具体表现在，入腹腔后只能以棉签、盐水纱布帮助显露手术野；分离肝下下腔静脉时，推移右肾，不接触肝脏来达到显露。
3.2.3 经腹主动脉灌注供肝
我们采用腹主动脉插管、钳夹胸腔降主动脉的经肝动脉、门静脉的“双灌注法”，4℃灌注液部分经肝动脉入肝，部分通过腹腔脏器回流后经门静脉入肝，收到肝动脉及门静脉双重灌注的效果，使肝脏的热缺血时间降至最低，减少了热缺血损伤。
3.2.4 切断肝上下腔静脉和门静脉
我们对切断肝上下腔静脉采用了一个科学合理的方法，推肝脏向下使膈肌与肝脏之间的下腔静脉壁形成轻微的张力，这样很容易由一侧剪开并沿膈肌环剪下下腔静脉，这样的肝上下腔静脉正好符合要求，也节省了修肝时间。门静脉切断的位置应尽量选在脾静脉的水平，这样可使门静脉有一较大的外口。
3.2.5 修肝的技巧
整个修肝过程均应在0～4℃保存液中进行。在修剪肝上下腔静脉时要注意检查左隔下静脉的汇入处是否有破口；肝门部的修整要注意勿过多破坏胆道的血供；门静脉袖套管制作时最好以幽门静脉的结扎线结刚好外翻于套管壁外为佳，以免结扎线结影响门静脉的血流。
3.2.6 受体肝脏的切除
受体肝脏的驱血是将受体肝脏内的血驱入腔静脉系统，即所谓的“自体输血”［4］。一般驱血2.5～3.5 ml，时间1.0～1.5 min。切除受体肝脏时，要尽量多保留受体肝下及肝上下腔静脉［5］。
3.2.7 肝上下腔静脉的吻合
肝上下腔静脉的吻合采用内膜对内膜的连续缝合，尤其在受体血管壁外带有肝脏组织时，这样吻合可以完全将血管外的肝脏组织吻合在血管腔外。吻合时针距和边距应适当，均在0.8 mm左右，以防漏血。
3.2.8 门静脉、下腔静脉和胆总管的套接
门静脉和下腔静脉套接前确保供肝静脉套管位置放正，无扭转，这样套接后可避免静脉扭曲、成角。胆总管套接时内支架管不可插至左右肝管汇合处，供受体胆管断端一定要拉拢，不能扭曲，以免引起胆道阻塞。胆总管套接后用大网膜覆盖供肝胆总管，以避免日后胆总管坏死。
3.3 术中术后处理
3.3.1 补液
在手术过程中，我们主要通过受体肝脏驱血时顺便补液，一般用37℃贺斯液2.5～3.5 ml为恰当；在手术过程中在大鼠的腹腔内及移植肝的表面，间断地喷滴37℃乳酸钠林格氏液，保持腹腔内湿润；手术结束后，酌情从阴茎背静脉补液2～3 ml。
3.3.2 缩短无肝期时间
在实验过程中我们注重手术的每一细节，完善了手术的每一步骤，基本上避免了手术意外，保持有一较短的无肝期时间，此实验平均无肝期时间是（14.27±1.98）min。我们认为较短的无肝期时间是手术成功和术后长期生存的关键因素。
如何缩短无肝期时间，我们的经验是：①熟练和完善的手术步骤是缩短无肝期时间的基础。②受体肝上下腔静脉的分离，尤其后壁的分离要到位，以保证有足够的肝上下腔静脉壁作吻合。③无肝期开始前，把无肝期所用的所有器械准备好，放到位。
3.3.3 抗感染
手术器械和自制材料浸泡消毒；术毕在腹腔及皮下滴两滴庆大霉素（4 万单位/ml）预防感染；手术后的大鼠单笼饲养，垫料干净。通过上述措施，我们的受体大鼠无一例发生感染。
参考文献
［1］Kamada N， Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat［J］. Transplantation，1979， 28(1):47-50.
［2］Kamada N， Calne RY. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat［J］. Surgery， 1983， 93（1）:64-69.
［3］余斌，秦磊，钱海鑫. 大鼠肝移植的麻醉［J］. 苏州大学学报:医学版，2005，25（2）：245-247.
［4］Lee S， Charters AC， Chandler JG， et al. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat［J］.Transplantation， 1973，16(6):664-669.
［5］谢嵘， 徐三荣.改良“袖套管法”大鼠原位肝移植模型的建立［J］.江苏大学学报：医学版，2006，16（5）：392-395.