shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响

　　　　作者：方莉莉， 许文林， 陈琛， 房新建， 陈巧云， 李娟

【摘要】 目的： 探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制。方法： 针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1，2，3，采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞，RTPCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1，MRP1，topoⅡ，GST的mRNA水平；蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平；MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度（IC50值）。结果： K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞，差异有统计学意义（P&<0.01），且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞；转染shRNA后，K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调，其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义（P&<0.05），以shRNA3组下调最显著，并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调；转染48 h后K562/A02细胞中MDR1，MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调，以shRNA3组下调最显著，分别下调（39.7±1.21）％，（29.1±0.97）％，（28.2±1.04）％，GST基因表达则无明显变化；阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加，其中以shRNA3组最显著。结论： VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达，不同干扰片段的沉默效果不同，并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性，其机制可能与MDR1，MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系。

【关键词】 血管内皮生长因子； RNA干扰； K562/A02细胞； 多药耐药

　　［Abstract］ Objective: To study the relationship between vascular endothelial growth factor(VEGF) and multidrug resistance of human leukemia cell line K562/A02 by RNA interference， and then the mechanism was explored.Methods： The VEGF shRNA chain1，2 and 3 were designed，synthesized， then transfected into K562/A02 cells line by lipofectamine 2000 reagent.RTPCR was used to detect the expression of VEGF and MDRrelating genes MDR1，MRP1，topoⅡ，GST in mRNA level; Western blotting was used to analyzed the expression of VEGF in protein level; MTT was used to determine the IC50 of transfectional cells to doxorubicin. Results： Compared to K562 cell，the expression of VEGF in K562/A02 cell was even more(P&<0.01)，and after VEGF shRNAs were transfected into K562/A02 cells，the expression of VEGF at the mRNA level were decreased，and there were statistical difference between VEGF shRNA2 group or VEGF shRNA3 group and HK group(P&<0.05)，the greatest decrease was seen in cells transfected with VEGF shRNA3;and the protein level of VEGF were also downregulated. The MDR1，MRP1，topoⅡ mRNA of K562/A02 cell were significantly decreased; the greatest decrease was seen in VEGF shRNA3 group. The IC50 value of positively transfected group were lower than that of control groups. Conclusion： After silence of VEGF by shRNA，the mRNA expression of MDRassociated genes such as MDR1，MRP1 and topoⅡ in K562/A02 cells were downregulated，and the sensitivity of K562/A02 cell to doxorubicin were increased.

　　［Key words］ vascular endothelial growth factor; RNA interference; K562/A02 cells; multidrug resistance　　多药耐药（MDR）目前仍是急性白血病（AL）治疗的主要障碍，尽管新的化疗药物和化疗方案不断涌现，但仍有部分患者因化疗耐药而导致治疗失败。白血病细胞的耐药往往同时存在数种耐药机制，MDR1，MRP1等耐药相关基因的高度表达是白血病产生多药耐药的主要原因之一。血管内皮细胞生长因子（VEGF）作为最重要的促血管生成因子之一，在肿瘤增殖、浸润和转移中起着重要作用。最近的研究表明［1］，在急性白血病初诊、缓解、难治/复发各组骨髓及外周血中，VEGF水平均高于正常对照组，特别是在难治/复发性AL患者中，VEGF的表达水平最高，表明VEGF水平的变化和白血病病情、预后密切相关。因此，我们采用RNA干扰技术阻断白血病细胞株K562/A02细胞中VEGF的自分泌作用，观察细胞对药物敏感性的变化，并针对VEGF影响K562/A02细胞多药耐药的作用机理进行初步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　转染试剂Lipofectin2000，Trizol试剂、胞核/胞质蛋白提取试剂盒、DAB显色试剂盒、RPMI1640培养液及无血清无抗生素OPTIMEMI培养液购自Invitrogen公司，RTPCR相关试剂购自Fermentas公司，VEGFA鼠单克隆抗体购自Ebioscience公司，VEGF shRNA1，2，3及通用阴性对照HK由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。人慢性粒细胞性白血病细胞系K562细胞购自中科院上海细胞库，K562/A02细胞购自南京凯基生物有限公司。

　　1.2 VEGF shRNA1，2，3的合成

　　以人VEGF mRNA序列(NM_001025366，NM_001025367，NM_001025368，NM_001025369，NM_001025370，NM_001033756、NM_003376)同源CDS序列设计shRNA双链，本研究选取的VEGF mRNA的靶位点分别是：shRNA1（636～654）：5′GGCGTCGCACTGAAACTTT3′，shRNA2（1352～1370）：5′GCGGATCAAACCTCACCAA3′，shRNA3（1414～1432）：5′GTGAATGCAGACCAAAGAA3′。

　　1.3 VEGF shRNA的转染

　　参照LipofectamineTM 2000 Reagent说明书，取停药2周的K562/A02细胞，无菌PBS洗1次，接种于培养瓶，每瓶接种细胞106，共设5组：分别为K562/A02（未转染组）、HK组（转染随机片段组）、shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组，其中HK组和K562/A02为对照组，转染shRNA质粒的细胞为3个阳性转染组。配制A液：6.0 μg shRNA溶于200 μl RPMI1640培养液；配制B液：20 μl Lipofectamine溶于200 μl RPMI1640培养液。将A，B两液混合，室温下静置30 min后加入待转染细胞中。37℃，5%CO2培养箱常规培养6～ 24 h，弃去培养液，换完全培养液继续培养。

　　1.4 RTPCR检测VEGF及相关基因的表达

　　于转染24 h，48 h后分别收获细胞，PBS洗涤3次，用Trizol Reagent提取总RNA，根据逆转录条件参照AMV酶说明书合成cDNA，取等量cDNA分别以各自引物测定各组细胞中相关基因βactin，VEGF，MDR1，MRP1，topoⅡ，GST(引物序列见表1)的表达量，扩增产物在含0.5 mg/L溴乙啶的1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离，于凝胶成像仪上扫描定量，以βactin作为内参照进行质控和标化。表1 相关基因PCR引物

　　1.5 蛋白质印迹法检测VEGF蛋白的表达

　　于转染48 h后收获细胞，PBS洗涤3次，按胞核/胞质蛋白提取试剂盒说明书提取胞质蛋白，行BCA蛋白制作标准曲线后定量，取50 μg总蛋白加适量上样缓冲液100℃煮沸5 min变性，12%SDSPAGE电泳，1 mA/cm2恒流半干转膜，5%的脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，以GAPDH（1∶3 000）作内参照，鼠抗人VEGF抗体（1∶500），4℃过夜，洗涤液洗膜3次，10 min/次，山羊抗鼠二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，洗膜同上，DAB显色，拍照。

　　1.6 MTT法检测细胞对多柔比星的IC50值

　　分别取转染24 h，48 h后的上述5组细胞各以105/ml接种于96孔板上，2×104/孔，各取4个复孔，加入不同浓度的多柔比星，培养48 h后加MTT 20 μl/孔，37℃，5%CO2培养箱继续孵育4～6 h，弃去上清液，加DMSO 200 μl/孔，振荡20 min，使紫色结晶溶解，在490 nm波长的酶标免疫测定仪上检测各组的光密度值，然后采用IC50值计算软件分别计算各组细胞的IC50值，相对逆转率=（对照组IC50-处理组IC50）／对照组IC50。实验重复4次。

　　1.7 统计分析

　　计量资料以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS11.5统计分析软件对实验数据进行统计学处理，两组资料比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 K562细胞和K562/A02细胞VEGF的差异性表达

　　PCR结果发现：K562和K562/A02细胞中VEGF mRNA与βactin的灰度比值分别为0.518±0.047，0.814±0.124，差异有统计学意义（P&<0.01），见图1a；蛋白质印迹结果也显示：以GAPDH为内参，K562/A02细胞VEGF蛋白表达明显高于K562细胞，见图1b。

　　2.2 shRNA转染后K562/A02细胞VEGF mRNA的表达

　　RTPCR分别检测转染24 h，48 h及72 h后5组细胞VEGF mRNA的表达，见图2。5组待测样本的cDNA均可扩增出强度基本一致的βactin的特异性产物，可用于靶基因表达分析。转染shRNA后，K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调，其中shRNA2组和shRNA3组与HK组相比差异均有统计学意义。转染24 h，48 h，72 h后shRNA3对VEGF mRNA的抑制率分别为（29.6±1.1）%，（45.9±1.6）%和（43.2±1.5）%。

　　2.3 shRNA转染后K562/A02细胞VEGF蛋白的表达

　　蛋白质印迹法检测5组细胞VEGF蛋白的表达，可见40 kD左右有一条特异条带，为目的蛋白条带，以GAPDH为内参照，转染组与HK组比较，shRNA1组、shRNA2组VEGF蛋白表达量略有下降，shRNA3组VEGF蛋白表达明显下调（图3）。

　　2.4 shRNA转染后K562/A02细胞耐药相关基因的表达

　　见图4。5个待测样本的cDNA均可扩增出强度基本一致的βactin的特异性产物，可用于靶基因表达分析。转染shRNA后的K562/A02细胞MDR1，MRP1，topoⅡ表达均出现不同程度下调，以shRNA3组下调最明显，与HK组相比，分别下调（39.7±1.21）％，（29.1±0.97）％，（28.2±1.04）％，GST表达无显著变化。

　　2.5 shRNA转染后K562/A02细胞的药物敏感性

　　见表2。转染shRNA1，shRNA2及shRNA3的3　　组细胞对多柔比星的IC50值均低于随机对照HK组，其中以shRNA3组下降最为明显，差异有统计学意义（P&<0.05）；未转染组与HK组细胞对多柔比星的IC50值差异无统计学意义。

3 讨 论

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)具有高效催化、强特异性、毒性低等优势，较其他反义技术能更有效下调胞质mRNA表达。体外合成的小分子干扰RNA(small interfenring RNA，siRNA)制备成本高，不稳定且易降解，在细胞内有效时间短，而短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)相对较稳定，有效维持时间更长，为RNAi技术的应用提供了更好的方法。人VEGF基因由8个外显子和7个内含子组成，第1～5外显子编码的部分是VEGF的核心区域，用于维持二聚体空间结构的8个特征性的半胱氨酸残基就处于这个核心部分。因此，本课题设计3个shRNA干扰片段分别针对VEGF基因第2～5外显子，采用瞬时转染法分别导入K562/A02细胞。结果显示，3个shRNA干扰片段对VEGF的抑制作用不同，其中shRNA3的干扰作用最显著，VEGF蛋白的表达情况与基因变化基本一致。说明shRNA的导入可以抑制耐药白血病细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。

　　研究表明，肿瘤患者血清中VEGF含量的高低与疾病的预后密切相关。肺癌患者血清中VEGF的含量越高，疾病分期越晚，疗效越差，预后不佳［2］。慢性髓细胞白血病急变期的细胞中VEGF的表达量明显高于慢性期，细胞VEGF的表达量与疗效及预后呈负相关［3］。Avramis等［4］的研究显示VEGF可增强白血病细胞对紫杉醇和长春新碱的抵抗，抑制VEGF可提高白血病细胞对化疗药物的敏感性。Kautoh等［5］发现用VEGF处理的CMK86细胞系对化疗药物依托泊苷或多柔比星有明显的抵抗效应。由此可见，肿瘤细胞VEGF的表达量可能与肿瘤多药耐药有一定的相关性。我们的研究结果显示K562/A02细胞VEGF的表达水平明显高于K562细胞，并且VEGF shRNA可以增加K562/A02细胞对多柔比星的敏感性。

　　目前已证实的白血病耐药机制包括：①转运诱导的耐药，如Pgp、多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药相关蛋白（LRP）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）等使化疗药物排出增加。②凋亡诱导的耐药，如拓扑异构酶Ⅱ（topoⅡ）通过改变受损的DNA的拓扑结构，利于受损的DNA的修复，而导致耐药。③代谢诱导的耐药，如谷胱甘肽转移酶使药物失活增加。④药物靶点诱导的耐药。在治疗耐药的乳腺癌时，同时应用抗VEGF受体的单抗，阻断VEGF的自分泌作用后，能明显增强化疗的效果，逆转肿瘤细胞Pgp介导的耐药性［6］。Zhang等［7］观察VEGF165在内皮细胞对抗癌药物的敏感性方面的作用时，结果发现，VEGF165介导的HDMEC多药耐药表型对多种药物耐受，部分归因于LRP和MRP的上调。沈慧玲等［8］发现抗VEGF抗体能明显抑制白血病细胞topoⅡ的表达，细胞酶活性下降，促进DNA断裂，并且呈现较好的量效关系，表明VEGF抑制肿瘤细胞凋亡的机制和上调细胞topoⅡ表达密切相关。由我们的研究结果可初步推断，VEGF shRNA增加耐药白血病细胞对多柔比星的敏感性可能与下调MDR1，MRP1及topoⅡ等基因的表达有关，但具体的作用机理还有待进一步研究。VEGF可以通过自分泌途径作用于肿瘤细胞表面受体使之发生磷酸化作用，进而激发胞内蛋白质发生一系列磷酸化反应，如PI3K/AKT，MAPK/ERK，Ras GTP酶活化蛋白等活化，从而产生生物学效应。然而有报道表明抑制PI3K/AKT通路的活化可以抑制白血病细胞中MDR1，MRP1基因的表达［9，10］。另有报道发现抑制ERK的磷酸化能够抑制MDR1，topoⅡ的表达［11，12］。因此，我们推测VEGF shRNA可能通过抑制PI3K/AKT或MAPK/ERK信号通路的活化来影响耐药相关基因的表达。

　　因此，我们认为VEGF作为肿瘤血管新生的关键因子之一，不仅通过刺激血管内皮细胞的生长而促进造血系统肿瘤的增殖，而且可能通过其旁分泌或自分泌途径，在一定程度上赋予白血病细胞对化疗药物耐药的能力。利用RNA干扰技术阻断VEGF的表达，为有效逆转白血病多药耐药提供新的方向，也为临床成功治疗白血病提供新的策略。

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