作者：许国锋 王群立 王勇 罗光华 张俊 郑璐
【摘要】 目的： 研究维吾尔族及哈萨克族人肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor 2， TNFR2）第6外显子196位点基因多态性与冠心病的相关性。 方法： 采用病例对照研究的方法，用ShineRoar探针技术检测117名冠心病患者（其中维吾尔族人89名，哈萨克族人28名）以及106名健康体检者（其中维吾尔族人51名，哈萨克族人55名）的TNFR2第6外显子196位点的基因型。 结果： 维吾尔族冠心病患者与一般人群TNFR2第6外显子196位点等位基因及基因型频率的差异没有统计学意义；哈萨克族TNFR2第6外显子196位点G等位基因携带者发生冠心病的风险明显高于T等位基因携带者（OR=3.560， 95%CI: 1.157～8.139， χ2=9.73， P=0.002）；TG或GG基因型携带者发生冠心病的风险明显高于TT基因型携带者。两分类Logistic回归分析结果显示，在控制性别和年龄不变的情况下，哈萨克族TNFR2第6外显子G等位基因与冠心病的发生明显相关（OR=4.100， 95%CI: 1.315～12.780， χ2=5.916， P=0.015）。结论： 哈萨克族TNFR2第6外显子G等位基因是发生冠心病的主要危险因素之一。
【关键词】 冠心病； 肿瘤坏死因子受体2； 基因多态性
［Abstract］ Objective: To study the association of biallelic polymorphism at position 196 in exon 6 of tumor necrosis factor receptor 2(TNFR2) gene and with coronary artery disease(CAD).Methods： A prospective case control study was designed in this investigation.One hundred and seventeen patients(89 were Uighur and 28 from Kazakh) with CAD were compared to with 106 health examination volunteers(51 were Uighur and 55 from Kazakh).Genotyping was performed by ShineRoar probes analysis. Results： There was no significant difference in genotype frequencies for TNFR2 polymorphism between Uighur patients with CAD and Uighur health examination volunteers.Kazakh people with G allele of TNFR2 gene had more risks of development of CAD（OR=3.560， 95% CI: 1.157～8.139， χ2=9.73， P=0.002） than those with T allele.Further analysis with adjustment for sex and age demonstrated that G allele at position 196 in exon 6 of TNFR2 gene was significantly associated with CAD （OR=4.100， 95% CI: 1.315～12.780， χ2=5.916， P=0.015）. Conclusion： Tumor necrosis factor receptor 2 gene polymorphism was independent risk factor of development of CAD among Hazakh people.
［Key words］ cardiovascular disease; tumor necrosis factor receptor 2; genetic polymorphism
研究表明，遗传因素和炎症是动脉粥样硬化与冠心病（coronary artery disease， CAD）发生发展中的两大重要因素，一些炎症介质的遗传变异会增加或降低冠心病的风险。有证据表明一些炎症分子基因编码的改变与冠心病相关。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha， TNFα）是一类致炎细胞因子，可集中在粥样硬化斑块中，并通过增加炎症反应来促进粥样斑块的形成［1-6］。TNFα通过细胞膜上的肿瘤坏死因子受体（ tumor necrosis factor receptor，TNFR） 连接而发挥广泛的生物学活性作用。TNFR有两种（TNFR1， TNFR2），其中TNFR2的基因定位在染色体1p36.2；Komata 等发现TNFR2基因存在第6外显子196位点T→G的突变，可形成TT，TG及GG 3种基因型［7，8］。
我们先前的研究结果表明，尽管在汉族人群中TNFR2第6外显子196位点GG型基因携带者发生冠心病及冠状动脉粥样硬化的风险明显高于TT型基因携带者，但两分类Logistic回归分析显示，在控制性别和年龄不变的情况下，TNFR2第6外显子基因多态性不是汉族人发生冠心病及冠状动脉粥样硬化的独立风险因素［9］。由于冠心病的易感性在不同种族人群中有可能存在遗传异质性，因此本研究继续采用ShineRoar探针技术［10］分析新疆地区维吾尔族及哈萨克族人群TNFR2基因多态性与冠心病的关系。
1 对象与方法
1.1 对 象
维吾尔族及哈萨克族冠心病患者（心绞痛或心肌梗死患者，经冠状动脉造影证实1支或1支以上血管直径狭窄50%以上者）分别为89及28名，平均年龄分别为（56.6±11.7）及（53.0±10.2）岁，其中男性分别为70及24名，女性分别为19及4名。随机入选的51名维吾尔族及55名哈萨克族健康体检者作为一般人群组，平均年龄分别为（30.1±16.1）及（38.3±16.4）岁，其中男性分别为19及18名，女性分别为32及37名。
1.2 仪器与试剂
Taq DNA 聚合酶， 4×dNTPs， 10×PCR缓冲液以及MgCl2等购自上海申能博彩公司；TNFR2基因196位点引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成和修饰；本研究所使用的引物和探针详见表1。PCR扩增及融解曲线分析均在罗氏公司LightCycler（版本号：3.5）基因扩增检测仪上进行。 表1 TNFR2基因196位点单核甘酸多态性检测
1.3 检测方法
基因组DNA用UIIQ10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提取。PCR总反应体系25 μl，含40～80 ng的DNA模板，2.5 μl 10×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2，0.5 μl 4×dNTPs，1.25 U Taq DNA聚合酶。引物和探针分别为10 pmol和2 pmol。PCR反应条件如下： 95 ℃预变性1 min，接着95℃ 0 s，61℃ 10 s， 72 ℃ 10 s（温度转换率均为20℃/s），运行40个循环；扩增产物的融解曲线分析程序包括以下步骤：95℃ 30 s，42℃ 4 min， 然后逐渐升至80℃（温度转换率为0.1℃/s，持续收集荧光数据）。
1.4 统计学分析
应用HardyWeinberg平衡定律对群体的遗传平衡进行检验；CAD组及一般人群组间TNFR2基因第6外显子196位点等位基因及基因型频率比较用χ2检验，用两分类Logistic回归分析冠心病及冠状动脉粥样硬化的相关影响因素，P&<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 TNFR2基因型结果判读
TNFR2基因第6外显子196位点双等位基因单核苷酸多态性标志（T/G）产生3种基因型，分别为TT纯合子、GG纯合子和TG杂合子。PCR扩增产物长度为529 bp，通过特异性ShineRoar探针（含敏感探针和锚定探针）杂交后，在荧光通道1（F1）进行检测。其结果判断及融解曲线特征详见
参考文献
［10］。2.2 基因型遗传平衡分析
各组TNFR2第6外显子196位点基因型频率经HardyWeinberg平衡定律检验，均为达到遗传平衡的群体（表2）。
2.3 等位基因及基因型发病风险分析
维吾尔族冠心病患者与一般人群TNFR2第6外显子196位点等位基因及基因型频率的差异没有统计学意义；哈萨克族TNFR2第6外显子196位点G等位基因携带者发生冠心病的风险（OR=3.560， 95% CI 1.157～8.139， χ2=9.73， P=0.002）明显高于T等位基因携带者；TG或GG基因型携带者发生冠心病的风险明显高于TT基因型携带者（表3）。 表2 不同组TNFR2基因第6 外显子196位点基因型遗传平衡分析表3 TNFR2基因第6外显子196位点等位基因及基因型携带者冠心病发病风险分析
2.4 哈萨克族TNFR2第6外显子196位点G等位基因与冠心病关系的Logistic回归分析
以性别、年龄及等位基因为自变量，冠心病作为因变量，两分类Logistic回归分析结果显示，在控制性别和年龄不变的情况下，哈萨克族TNFR2第6外显子G等位基因与冠心病的发生明显相关，是发生冠心病的主要危险因素之一（表4）。 表4 哈萨克族TNFR2 G等位基因与冠心病
3 讨 论
TNFR2基因第6外显子196位点T→G的突变导致了蛋氨酸（M）→精氨酸（R）的改变［8］。本研究表明维吾尔族人群TNFR2基因第6外显子196位点的突变与冠心病没有明显的相关性，但哈萨克族人群该基因位点的突变却明显和冠心病的发生有关，并且Logistic回归分析表明，在调校了性别和年龄后，G等位基因仍然是哈萨克族人发生冠心病的主要危险因素。这说明冠心病的易感性在不同种族人群中的确存在遗传异质性，有可能在哈萨克族人群中具有另一个冠心病的易感基因和TNFR2基因第6外显子196位点G等位基因相连锁，其详细原因和具体机制有待于进一步研究。
随着心血管疾病危险因素（吸烟、大量饮酒、缺少运动、肥胖、人口老龄化、高血压、高胆固醇、糖尿病或糖耐量下降以及心理行为因素等）的增加，冠心病发生的危险成几何倍数上升。虽然遗传倾向是冠心病发生的重要因素之一，但其仅是内在原因，它只有和其他危险因素相结合，才能使冠心病的发病率升高。本研究表明携带有TNFR2基因第6外显子196位点G等位基因的哈萨克族人发生冠心病的风险明显较携带有T等位基因的人高，因此这类人群更应注意调整生活方式，如控制饮食、烟、酒以及加强体育锻炼等，以避免或减少冠心病事件的发生。
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［10］ 罗光华， 郑 璐， 张晓膺， 等.ShineRoar探针技术检测单核苷酸多态性［J］.中华检验医学杂志， 2007，30（6）:609-612.