小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定

　　　　 作者：石燕 戴晓丽 薛渊 何志强 周成林

　　 王胜军 苏兆亮 陈建国 夏圣 邵启祥 黄新祥 许化溪

【摘要】 目的： 克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1（high mobility group box1，HMGB1）。方法： 从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，应用RTPCR获得小鼠HMGB1cDNA，经PCR扩增小鼠HMGB1基因；通过TA克隆将该基因构建到PMD18T载体中，测序鉴定；将该基因插入pET28a(+)表达载体，IPTG诱导后，可表达相对分子质量约30 kDa的蛋白。蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白。结果： 经RTPCR扩增得到648 bp的DNA片段，序列分析显示与基因库中报道的已知序列完全一致；构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体，经诱导表达、蛋白质印迹鉴定，获得相对分子质量约30 kDa的融合蛋白。结论： 成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因，为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础。

【关键词】 高迁移率族蛋白； 克隆； 原核表达

　　［Abstract］ Objective: To clone and express mouse high mobility group box chromosomal protein1(HMGB1)gene.Methods： Total RNA was extracted from mouse spleen cells， and the whole length of HMGB1 gene was obtained by RTPCR.The HMGB1 gene was cloned into PMD18T vector by TA clone and sequenced. Then the gene was inserted into pET28a(+) expression vector. identified by Western Blot. Results： The target DNA sequence of HMGB1 was obtained by RTPCR which was about 648 bp length，sequencing results showed that HMGB1 gene was exactly consistent with the sequence reported in GenBank;Western Blot identified there was a protein strap about Mr.30 000.The HMGB1 protein was successfully expressed. Conclusion： Clone and express mouse HMGB1 gene. It might provide a foundation for further study on the protein of HMGB1 function.

　　［Key words］ high mobility group box1; clone; prokaryotic express

　　高迁移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)是高迁移率族蛋白超家族的成员之一，是一种含量丰富的非组蛋白核蛋白［1］。编码区由648 bp组成，编码215个氨基酸，在核内具有调节基因转录和表达等作用；在细胞外HMGB1可以诱导某些炎症因子的释放，作为一种晚期炎症因子参与脓毒血症的发病过程［2，3］。最近研究表明，HMGB1也参与自身免疫性疾病的发病过程，如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等［4，5］。但其确切的作用机制尚未完全清楚。本研究克隆并表达了小鼠HMGB1，经鉴定表明获得了小鼠HMGB1的融合蛋白，为进一步探讨HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中的作用机制，寻找类风湿性关节炎治疗的新途径奠定了基础。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　大肠埃希菌Rossta，DH5α，质粒pET28a(+)为本室保存；Trizol购自Invitrogen 公司；DNA Gel Extraction Kit、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq酶、pMD18T 载体购自TaKaRa宝生物工程(大连) 有限公司；AMV Reverse Transcriptase， RNase Inhibitor均购自Sigma公司;鼠抗HisTag单克隆抗体购自Omiga公司;HisTrapHP购自GE Health care公司。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 PCR引物和设计 根据基因库中小鼠HMGB1 mRNA序列，设计编码区的特异性引物：上游引物序列为P1: 5′CGAGCTCATGGGCAAAGGAGATCCT3′，下游引物序列为P2： 5′CCAA GCTTTTATTCATCATCATCATC3′，在上下游引物5′端分别插入Sac Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基，以便于酶切、克隆。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.2 总RNA的提取及RTPCR 颈椎脱臼处死成年小鼠，无菌取脾脏，经充分研磨过滤后，用Trizol一步法提取总RNA，逆转录获得cDNA模板，然后用HMGB1编码区特异性引物进行PCR扩增。循环条件为：94℃ 30 s， 57℃ 30 s， 72℃ 45 s， 共30 个循环。取5 μl PCR产物， 用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后， 紫外透射分析仪观察结果。

　　1.2.3 TA克隆PCR扩增产物到PMD18T载体 回收PCR产物，TA克隆PMD18T。转化大肠埃希菌DH5α感受态，培养后挑取单个菌落、提取质粒、Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，将阳性重组子命名为PMD18THMGB1并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序证实。

　　1.2.4 HMGB1表达载体的构建和诱导表达 用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PMD18THMGB1和表达质粒pET28a(+)，胶回收后连接转化大肠埃希菌Rossta感受态细胞。挑取生长良好的菌落并接种于3 ml LB培养基中，37℃，250 r/min增菌过夜，次日以1∶100接种于300 ml LB培养基中，37℃培养至D(600) nm=0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，30℃诱导4 h后离心收集细菌，超声后分别取上清和沉淀，以12 g/dl的SDSPAGE及蛋白质印迹分析鉴定表达的蛋白。经限制性内切酶分析，含正确序列的克隆重组质粒命名为pET28HMGB1。

2 结 果

　　2.1 HMGB1编码区cDNA的获得与鉴定

　　通过1%的琼脂糖凝胶电泳证实，经逆转录获得的一条约648 bp大小的特异性条带，与预期目的片段大小相符（图1）。

　　2.2 PMD18THMGB1的双酶切鉴定结果

　　将重组质粒DNA经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳，获得一条约为648 bp大小的目的条带，与预期结果相符(图2)。

　　2.3 HMGB1质粒测序结果

　　将重组质粒PMD18THMGB1送上海生工工程技术有限公司进行测序，测序结果与基因库中的序列比对完全正确。

　　2.4 pET28HMGB1原核表达载体的构建及鉴定

　　测序正确的PMD18THMGB1及pET28a(+)，分别用Sac Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切后，回收目的片段HMGB1和载体pET28a(+)，然后用T4连接酶连接构建成重组质粒pET28HMGB1。重组质粒转化Rossta感受态，挑取单个菌落提取质粒，Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，1%的琼脂糖凝胶电泳，在大约648 bp的位置可见目的条带。

　　2.5 pET28HMGB1的原核表达及鉴定

　　pET28HMGB1的Rossta转化菌，在30℃条件下IPTG诱导超声，目的蛋白以可溶性和包涵体形式存在。SDSPAGE电泳可以见到在大约30 kD处有一条带，与预期结果相同（图3）。蛋白质印迹鉴定结果见图4。

3 讨 论

　　HMGB1是近年来发现的晚期炎症介质，相对分子质量约为30 kD，在哺乳动物中高度保守，表达谱较为广泛。HMGB1作为核内蛋白，是核小体的非组蛋白，主要参与核小体的稳定，异化基因转录等。在细胞坏死的情况下HMGB1可释出细胞，但在细胞凋亡时HMGB1则与染色体结合并连同死细胞被机体的吞噬细胞清除，部分HMGB1可由活化的巨噬细胞分泌，但其具体的出胞机制尚未清楚。有研究表明巨噬细胞活化后，可以增加HMGB1的表达和释放［6］。在胞外，HMGB1可以刺激滑膜细胞释放TNFa，IL1，IL6等致炎因子。类风湿性关节炎的发生发展与T，B淋巴细胞的活化有关［7］。近年来研究发现，TNF和HMGB1在类风湿性关节炎的发生发展过程中均作为重要的炎症介质参与炎症反应。封闭TNF的治疗方法已在类风湿性关节炎的治疗中取得了良好的效果。但另有研究发现，敲除TNF的小鼠不仅仍可发生类风湿性关节炎，而且TNF抑制剂治疗效果受到影响，这提示HMGB1等其他分子参与炎症反应的可能性。近年来，HMGB1在类风湿性疾病中的作用正日益受到人们的关注［8］。 本研究成功克隆了小鼠HMGB1编码区全长序列，并在大肠杆菌中获得了融合蛋白的表达，为进一步研究HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中的作用奠定了基础。

参考文献

［1］ Bustin M.Regulation of DNAdependent activities by the functional motifs of thehighmobilitygroup chromosomal proteins［J］.Mol Cell Biol，1999，19(8)：5237-5246.

［2］ Wang H， Yang H， Tracey KJ. Extracellular role of HMGB1 in inflamation and sepsis ［J］.Intern Med，2004，255(3):320-331.

［3］ Wang H， Yang H， Czura CJ，et al. HM GB1 as late mediator of lethal systemic inflammation［J］. Am J Respir Crit Care Med，2001，164(10):1768-1773.

［4］ RovereQuerini P，Capobianco A，Scaffidi P，et al. HMGB1 is an endogenous immune adjuvant released by necrotic cells［J］.EMBO Rep， 2004， 5(8):825-830.

［5］ Aneja RK，Tsung A，Sjodin H，et al. Preconditioning with high mobility group box 1(HMGB1) induces lipopolysaccharide(LPS) tolerance［J］. Leukoc Biol，2008，84(5):1326-1334.

［6］ 朱明光，常雅萍.高迁移率族蛋白B1的致炎细胞因子作用研究进展［J］.国际免疫学杂志，2006，29（4）：257-260.

［7］ 焦志军，王文红，陈 蕾，等.定量PCR检测类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Notch基因表达［J］.江苏大学学报：医学版，2007，17(6):534-546.

［8］ Urbonaviciute V， Fürnrohr BG， Meister S，et al. Induction of inflammatory and immune responses by HMGB1nucleosome complexes:implications for the pathogenesis of SLE［J］. J Exp Med，2008，205(13):3007-3018.