mig14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

　　　　 作者：夏秋风， 邹昕， 杜鸿， 高宇琳， 黄新祥

【摘要】 目的： 探查伤寒沙门菌mig14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用。方法： 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig14基因缺陷变异株，用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig14缺陷株基因表达差异，并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证。结果： 成功制备伤寒沙门菌mig14缺陷株，高渗应激早期mig14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调。 结论： mig14可能是一种调节基因，主要参与调节细菌的物质和能量代谢。

【关键词】 伤寒沙门菌； mig14； 高渗应激； 基因芯片分析

　　［Abstract］ Objective: To explore the function of mig14 of Salmonella enterica serovar Typhi in response to hyperosmotic stress.Methods： A mig14 gene deleted mutant of S.enterica serovar Typhi was constructed using the homologous recombination method by means of a suicide plasmid; the difference of the gene expression between the wild strain and the mig14 mutant at earlystage of hyperosmotic stress was investigated by genomic microarray assay and partially confirmed by real time quantity reverse transcription PCR. Results： Successfully constructed a mig14 mutant; about 77 and 72 genes were downand upregulated respectively at earlystage of hyperosmotic stress in mig14 mutant. Conclusion： mig14 may be a regulator， may primally regulate the substance metabolism and energy metabolism of Salmonella enterica.

　　［Key words］ Salmonella enterica serovar Typhi; mig14; hyperosmotic stress; DNA microarrays

　　原核生物的信号转导可由膜蛋白和胞内的效应调节蛋白构成的双组分调控系统执行。PhoP/PhoQ是许多革兰阴性菌都有的一个重要的双组分调节系统，在低镁或酸性条件下，膜上的PhoQ被激活发生磷酸化，后者再特异性地作用于胞内的PhoP，使其磷酸化激活［1］。磷酸化的PhoP可激活slyA，mig14等基因，这些基因与细菌耐受酸性环境有关［2， 3］。Brodsky等［2］已经证明mig14能介导伤寒沙门菌抵抗多种抗菌肽的杀伤作用，但机制目前还不清楚。从基因序列分析发现，mig14与DNA调节性蛋白基因有较小的同源性，提示它也可能是一种调节蛋白。有研究表明，在沙门菌高渗应激早期mig14基因表达量明显增高［4］，因此怀疑mig14在沙门菌耐受高盐渗透压环境中可能发挥着重要作用。本研究拟用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig14基因缺陷变异株，并通过用全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和mig14缺陷株在高渗应激早期的基因表达谱差异，以分析高渗应激条件下mig14在伤寒沙门菌中的作用。

1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌野生株GIFU10007，大肠埃希菌SPY372λpir， 大肠埃希菌DH5α，pMD18T载体，自杀质粒pGMB151。

　　1.1.2 引物 根据NCBI公布的伤寒沙门菌Ty2基因序列信息，在mig14基因上游和下游设计两对特异性PCR引物：P1A/P1B和P2A/P2B，P1A和P2B含BamHⅠ酶切位点，P1B和P2A含BglⅡ酶切位点。设计的上游片段F1长459 bp，下游片段F2长857 bp。根据treC，cydA，pagP和invF基因序列设计实时荧光定量RTPCR(qRTPCR)引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。 表1 引物序列表

　　1.1.3 主要试剂 限制性内切酶BglⅡ和Bam HⅠ，T4 DNA 连接酶，碱性磷酸酶，Ex Taq，dNTP，RNase H，XGal，DL2 000和λHind Ⅲ digest分子质量标准以及TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；质粒提取试剂盒（Axygen公司）；胶回收试剂盒（Promega公司）；IPTG（Sigma公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（Oxoid公司）；RNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒（Qiagen公司）；反转录试剂盒（Invitrogen公司）。

　　1.1.4 主要仪器 PCR仪（Mastercycler Personal，Eppendorf），高速冷冻离心机（Megafuge，HERAEUS），凝胶成像及分析系统（Syngene，Gene），核酸检测仪（BioPhotometer，Eppendorf），电穿孔仪（BioRad），电热恒温干燥箱（Ecocell），核酸杂交仪（RollerBlot HB3D，Techne），基因芯片扫描仪（GenePix 4100A，Axon）。

　　1.2 方法与步骤

　　1.2.1 制备伤寒沙门菌mig14缺陷株 伤寒沙门菌mig14缺陷株的制备

参考文献

［5］进行，分别用引物P1A/P1B和P2A/P2B扩增出mig14基因上、下游同源性片段F1，F2。用限制性内切酶BglⅡ消化F1和F2片段后再用T4 DNA连接酶连接。用胶回收试剂盒回收F1F2连接片段，即mig14基因同源性缺损片段。将回收的片段做TA克隆后筛选出阳性克隆T载体送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，以确保剔除的碱基数为3的倍数。从阳性T载体上用BamHⅠ酶切下F1F2连接片段后与自杀质粒pGMB151连接。再将连接产物用热击法转入E.coli SPY372λpir感受态细胞。筛选出带有mig14基因同源性缺损片段的阳性克隆质粒。提取阳性克隆的自杀质粒后直接用电击法导入伤寒沙门菌野生株，将首次在氨苄西林平板上筛选的阳性菌落在含5%蔗糖的LB平板上进行二次筛选，用PCR（引物P1A，P2B）观察伤寒沙门菌的重组变异情况。将连续3代完全重组菌定为稳定的缺陷变异株。

　　1.2.2 基因芯片分析实验 将伤寒沙门菌野生株和mig14缺陷株分别接种于1 ml低渗的LB液体培养基(含NaCl 50 mmol/L)过夜培养，第2天取100 μl接种于相应的低渗LB培养液20 ml中，37℃ 250 r/min培养至对数生长期，D（600 nm）约为0.6，加入1 ml 5 mmol/L NaCl于培养液中（含300 mmol/L NaCl）， 37℃ 250 r/min振摇培养30 min。将菌液于冰上放置30 min后离心（4 000 r/min，10 min，4℃）收集菌体，按照QIAGEN RNA提取试剂盒的方法提取细菌总RNA，并通过测浓度和纯度以及电泳观察的方法分析总RNA的质量。用DNase I消化残量DNA后，按照

参考文献

［4］进行RNA反转录和cDNA荧光标记、DNA芯片杂交和数据分析。

　　1.2.3 qRTPCR实验 在高渗应激早期分别提取伤寒沙门菌野生株和mig14缺陷株的总RNA，方法同“1.2.2”。20 μl qRTPCR反转录反应体系(4 μg总RNA，4 μl N8随机引物，1 μl dNTP，加灭菌蒸馏水至13 μl)，65℃温育5 min后置冰上，冷却1 min后加入5×Fs缓冲液4 μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，RNase out 1 μl，反转录酶SⅢ 1 μl。用PCR仪器进行反转录反应(25℃ 10 min，50℃ 50 min，70℃ 5 min)。

2 结 果

　　2.1 伤寒沙门菌mig14缺陷株

　　以野生株基因组DNA为模板进行PCR扩增，成功获得mig14基因上、下游同源性核苷酸片段F1和F2，并连接成F1F2，经TA克隆后，将F1F2二次克隆至自杀质粒pGMB151中，连接产物的克隆鉴定见图1，将阳性自杀质粒通过电击转化入野生株，进行重组筛选，结果获得稳定的完全重组mig14缺陷变异株（图2），并经DNA序列分析得到进一步确证。

　　2.2 基因芯片分析结果

　　先将野生株和mig14缺陷变异株在相同的条件下培养至对数生长期，再进行高渗应激，30 min后提取RNA，最后进行全基因组芯片分析，以比对整体基因表达差异。芯片杂交后采用GenePix Pro6.0 软件（Axon Instruments）并辅以Excel软件对全基因组芯片分析结果进行图片处理和数据分析。计算扣除背景后的各样点荧光信号值（均值），采用全局归一法（global normalization）对双色荧光数据进行标准化处理，并计算每个点杂交后不同荧光物质标记所得信号比值（Ratio），以表达１倍差异作为阳性变化阈值。结果显示，与野生株的基因表达相比，mig14缺陷株在高渗应激早期fliDS，motA和cheRBZ等17个鞭毛和动力相关基因以及SPI1毒力岛中的prgHJK等5个毒力基因表达均有明显下调，另有79个代谢酶类基因表达发生变化，其中下调的有37个基因，包括narGHJ，dmsAB，nrfACD，hypABCE，treBC，hybOABCDE和cydAB等，上调的有42个基因，包括sucAB，sucCD，sdhCDAB，astBD，fadAB和cyoABCE等；有3个调节基因invF，sdiA，caiF和一个假定的调节基因表达有明显下调；与药物耐受相关的基因pagP表达下调，ybjX表达则上调；此外，还有26个其他功能的基因（5个基因表达下调）和13个未知功能的基因（8个表达下调）也发生明显表达变化。从芯片分析结果可以推测mig14是一种调节基因，且可能主要参与调节伤寒沙门菌的物质和能量代谢以及鞭毛的装配和动力。

　　2.3 qRTPCR结果

　　为验证基因芯片分析结果，从基因芯片分析结果中选择分布在不同基因簇的基因，包括cydA，invF，pagP和treC基因，进行qRTPCR，比较分析伤寒沙门菌野生株和mig14缺陷株中相应基因表达情况(图3)。基因表达谱分析结果显示，变异株中cydA，invF，pagP和treC的mRNA水平分别为野生株中的0.47，0.44，0.44和0.25倍，而qRTPCR分析结果显示，变异株中的mRNA平均为野生株中的0.40，0.44，0.67和0.33倍。

　　3 讨 论

　　伤寒沙门菌是人类的肠道致病菌，从肠上皮细胞侵入人体后，能抵抗宿主的防御反应，引起严重的全身感染［6］。伤寒沙门菌侵入宿主时会遭受各种环境应激，包括胃酸性、小肠高渗以及宿主防御细胞的氧化反应等刺激。本次研究利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片开展基因表达谱差异分析，揭示高渗应激早期mig14缺陷株的全基因组表达变化，结果发现约149个基因的表达有显著改变，提示这些基因可能受到mig14影响。通过抽选4个不同操纵子的基因用qRTPCR进行验证，结果与芯片分析结果一致，进一步说明本次研究芯片分析的结果可靠。

　　本次芯片分析结果显示，在高渗应激30 min时伤寒沙门菌中众多鞭毛相关基因的表达受到mig14的影响。鞭毛是沙门菌的运动器官，也是一种重要的致病因子。约有50个基因与鞭毛的结构和功能相关，按照转录等级关系将这些基因分成3类，它们编码的产物分别是鞭毛装配过程中的早、中、晚期产物［7］，同时需要另一些基因的表达协助鞭毛的装配和运动，如连接蛋白CheW、蛋白激酶CheA、反应调节蛋白CheY、定子蛋白MotA 和MotB等。本次芯片实验结果中除了cheY，motB和fliT没有明显表达变化外，其他3类鞭毛基因和fliAZ在mig14缺陷株中均表达下调。因此推测mig14可能对鞭毛中晚期的装配过程以及细菌的动力有正调控作用。

　　本次芯片分析结果还显示在mig14缺陷株中pagP表达量降低，而ybjX表达量增高。有研究表明，pagP编码一种外膜酶蛋白，能催化脂质A2，3位点侧链棕榈酰（十六酰）化修饰，msbB编码的酶能催化脂质A的肉豆蔻酰（十四酰）化修饰。因此，两个基因都能增强细菌对阳离子抗菌肽的耐受作用［8， 9］，据此我们推测，mig14可能主要通过上调pagP基因的表达以发挥伤寒沙门菌对抗菌肽的耐受作用。当然这还需要作进一步的实验以确证。

　　TreC为海藻糖6磷酸盐水解酶，TreB为海藻糖特异的磷酸转移酶系统IIBC组分，这两个蛋白编码基因位于同一个操纵子。海藻糖6磷酸盐被TreC水解成葡萄糖和6磷酸葡萄糖，细菌能利用海藻糖6磷酸盐作为碳源，在高渗和低渗条件下生长。有研究报道细菌摄取并水解利用海藻糖6磷酸盐能起到低温防护的作用［10］。本次研究发现 mig14缺陷株中treC和treB基因都明显下调， 提示伤寒沙门菌有可能通过Mig14调节海藻糖6磷酸盐的代谢反应以适应环境渗透压的改变。

　　在沙门菌中NarX/NarL和ArcB/ArcA是调节发酵反应的两种双组分调控系统。细菌无氧呼吸产生的中间产物达到一定浓度后能激活这两种调控系统。伤寒沙门菌的narGHJ表达硝酸脱氢酶，dmsAB表达二甲亚砜脱氢酶，两类基因分别受NarX/NarL的正调节和负调节。在mig14缺陷株中这两个酶相应的基因表达均下调。伤寒沙门菌的sdhCDAB编码琥珀酸盐脱氢酶，lctD编码L乳酸脱氢酶，cyoABCDE编码细胞色素Cyto复合物，sodA编码锰离子依赖的超氧化物歧化酶，cydAB编码细胞色素Cytd复合物。在有氧条件下，前四类基因的表达上调，cydAB的表达下调。当发酵反应激活了ArcB/ArcA双组分调控系统后，能抑制前四类基因的表达，促进cydAB表达。在mig14缺陷株中前四类基因表达上调，cydAB的表达下调，由此推测Mig14对这些基因的影响可能与NarX/NarL及ArcB/ArcA双组分调控系统相似。　　 本实验初步揭示了伤寒沙门菌Mig14为一种调节因子，有关Mig14的结构和功能关系还需作深入研究。

参考文献

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