盐酸伊立替康脂质体冻干粉针的制备及其质量评价

　　　　　　作者：邱永宏，戈延茹，王成润，金一

【摘要】 　　目的： 研究盐酸伊立替康脂质体冻干粉针的制备方法，并对其进行初步的质量评价。方法： 以包封率为评价指标，比较四种不同的脂质体制备方法，对硫酸铵梯度法的制备工艺和处方进行单因素考察，筛选出冻干保护剂，并对冻干粉针进行稳定性影响因素试验。结果： 两种主动载药法制得的脂质体包封率更高；硫酸铵梯度法制备过程中，盐酸伊立替康脂质体的包封率受药脂比、硫酸铵浓度、孵育温度、孵育时间影响较大，受胆固醇磷脂比、空白脂质体外水相除盐方法影响较小；采用5％蔗糖与5％乳糖作为冻干保护剂冻干效果更好；所得冻干粉针对温度、光照较为敏感，也易受湿度影响。结论： 采用硫酸铵梯度法，经处方工艺条件的优化，可以获得较高包封率的盐酸伊立替康脂质体，5％蔗糖与5％乳糖是本脂质体较合适的冻干保护剂，初步的稳定性考察结果表明，本脂质体冻干粉针宜低温、避光、密封保存。

【关键词】 盐酸伊立替康； 脂质体； 冻干粉针； 硫酸铵梯度法； 稳定性

　　［Abstract］Objective: To investigate the preparation of irinotecan hydrochloride lyophilized liposomes and to evaluate their quality preliminarily.Methods： Judging by encapsulation efficiency(EE)， four different methods for preparing liposomes were compared， the singlefactor test research was applicated to study the formula and the preparation craft， support agents for lyophilization were screened， and the influencing factor test was applicated to study the stability of lyophilized liposomes. Results： High EE of liposomes was achieved by two active loading methods; under the ammonium sulfate gradient method， the EE of irinotecan hydrochloride liposomes was significantly affected by the ratios of drug to lipid， the concentrations of ammonium sulfate， incubation temperature and incubation time， and it was scarcely affected by the ratios of cholesterol to phospholipid or the saltsremoving methods; superior lyophilized powder could be obtained by using 5% sucrose and 5% lactose; the lyophilized powder was sensitive to temperature and illumination， and it was also affected by humidity. Conclusion： With the ammonium sulfate gradient method， after the optimization of the formula and the preparation craft we could get irinotecan hydrochloride liposomes with high EE; 5% sucrose and 5% lactose were suitable support agents for these liposomes. The preliminary assessment of stability showed that the lyophilized liposomes powder should be stored in low temperature， in sealed condition， and away from light.

　　［Key words］irinotecan hydrochloride; liposome; lyophilized powder; ammonium sulfate gradient method; stability
　　
　　伊立替康(Irinotecan，CPT11)，是一种半合成的喜树碱衍生物，为特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂。为增加伊立替康的水溶性，人们将其制备成盐酸盐［1］，即盐酸伊立替康，已上市的产品主要为盐酸伊立替康注射液（开普拓）及冻干粉针（艾力）。伊立替康是转移性结直肠癌的有效药物，而且具有很广的抗肿瘤谱。Ⅰ期、Ⅱ期临床研究结果表明，该药对化疗抗拒性肿瘤，如非小细胞肺癌、卵巢癌和宫颈癌有肯定疗效；另外它对胃癌、恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌、小细胞肺癌、皮肤癌、胰腺癌也有一定疗效［2-5］。
　　
　　伊立替康抗癌活性强，但不良反应亦较多，常见不良反应为食欲缺乏、恶心、呕吐、腹泻，白细胞和中性粒细胞减少、贫血及血小板减少，脱发和乙酰胆碱能综合征［6-8］。因此有必要改进其现有剂型，来增加它的适应证，减少其不良反应。脂质体作为胶体给药系统的一种，有着靶向、低毒、高效的优点［9，10］，但盐酸伊立替康等水溶性药物脂质体混悬液的稳定性普遍较差，因此本实验将盐酸伊立替康制备成脂质体冻干粉针，以期得到更为安全、有效、稳定的制剂。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 药品与试剂
　　
　　盐酸伊立替康（连云港杰瑞医化有限公司）；注射用大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；胆固醇（广东南方化玻有限公司进口分装）；Sephadex G50（Pharmacia公司进口分装）；葡萄糖、甘露醇（广东光华化工厂有限公司）；乳糖（新西兰）；磷酸二氢钾（浙江新安化工集团有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇（色谱纯，国药集团上海化学试剂有限公司）；其他试剂为分析纯。
　　
　　1.2 仪器
　　
　　RE52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（Sh3DⅢ，巩义市英峪予华仪器厂）；超声波细胞粉碎机（JY92Ⅲ2D，宁波新芝生物科技有限公司）；精密酸度计（PHS2C，上海雷磁仪器厂）；冷冻干燥机（LGj18，军事医学科学院实验仪器厂）；激光衍射粒度分析仪（Zetasizer 3000HS，英国马尔文公司）；精密电子天平（Sartorius BS110s，德国赛多利斯集团）；磁力搅拌器（851型，上海志威电器有限公司）；LC10 AT 液相色谱仪（日本岛津公司）；DiamonsilTM ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），C18预柱（4.6 mm×10 mm，5 μm）；紫外分光光度计（TU1800PC/SPC，北京普析通用仪器有限责任公司）。
　　
　　1.3 制备方法的筛选

　　1.3.1 薄膜分散法

　　称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，旋转蒸发成膜，并继续减压旋转蒸发15 min至乙醚除尽，加入1 mg/ml盐酸伊立替康水溶液10 ml，水化1 h后，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒。

　　1.3.2 逆相蒸发法

　　称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入1 mg/ml盐酸伊立替康水溶液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒。

　　1.3.3 pH梯度法

　　称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入pH=4.0的枸橼酸钠—柠檬酸缓冲液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒，得空白脂质体液10 ml［11］，向其中加入药物粉末10 mg，再用0.44 mol/L的碳酸钠溶液将脂质体液pH值调至7.5，搅拌2 min后，静置20 min，得载药脂质体。

　　1.3.4 硫酸铵梯度法

　　称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入250 mmol/L的硫酸铵溶液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒，得空白脂质体液10 ml，除去此空白脂质体外水相中的盐，再向其中加入药物粉末10 mg，搅拌2 min后，静置20 min，得载药脂质体。

　　1.4 包封率的测定

　　1.4.1 脂质体与游离药物的分离

　　采用Sephadex G50葡聚糖凝胶柱（长18 cm，内径1 cm；洗脱液：pH=4.0磷酸盐缓冲液；流速1 ml/min)分离脂质体与游离药物［12］，通过脂质体与游离药物的流出曲线，确定收集流出液1～10 ml为脂质体组分，11～35 ml为游离药物组分。

　　1.4.2 药物HPLC测定条件的确立

　　流动相：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.8 g，加水800 ml，溶解后，加三乙胺10 ml，用磷酸调节pH值至4.0，再加水至1 000 ml）（流动相各组分混合比为55∶5∶40）；流速：0.8 ml/min；柱温35℃；检测波长：254 nm；药物峰面积A对药物浓度C(μg/ml)的回归方程：A=21 680.4＋120 913.6 C(r=0.999 97，n=7，线性范围：0.05～50 μg/ml)。

　　1.4.3 游离药物量的测定

　　凝胶柱分离收集而得的游离药物组分，从中吸取20 μl进样，按“1.4.2”项下方法测定。

　　1.4.4 总药物量的测定

　　精密量取载药脂质体1.0 ml，置于25 ml容量瓶中，加入乳化剂OP（聚乙二醇辛基苯基醚）1.25 g，再加“1.4.2”项下流动相稀释至刻度，振摇至液体变澄清，从中吸取20 μl进样，按“1.4.2”项下方法测定。

　　1.4.5 包封率的计算
　
　　包封率＝1-游离药物量/总药物量×100％

　　1.5 硫酸铵梯度法制备盐酸伊立替康脂质体处方工艺条件的单因素考察
　　
　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，考察不同制备工艺条件（外水相除盐方法，孵育温度，孵育时间）与处方条件（药脂比，胆固醇磷脂比，硫酸铵浓度）对脂质体包封率的影响。

　　1.6 脂质体冻干粉针的制备

　　1.6.1 冻干工艺

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，向此载药脂质体混悬液中加入5％蔗糖与5％乳糖，磁力搅拌3 min使糖类溶解，分装至西林瓶，置于冰箱中-20℃预冻4 h，再转至冻干机中-50℃预冻15 h，打开油泵，于-50℃下抽真空12 h，即得脂质体冻干粉针。

　　1.6.2 冻干保护剂的筛选

　　按“1.6.1”项方法制备脂质体冻干粉针，以脂质体冻干后外观、水化难易程度、形态、包封率为评价指标，筛选出合适的冻干保护剂，进一步确立合适的冻干保护剂浓度。考察的冻干保护剂包括：甘露醇、乳糖、山梨醇、海藻糖、蔗糖、葡萄糖以及右旋糖酐［13］。

　　1.7 盐酸伊立替康脂质体冻干粉针的质量评价

　　1.7.1 粒径测定

　　将脂质体冻干粉针水化，并稀释至适当的浓度，置于激光衍射粒度分析仪中测定粒径。

　　1.7.2 稳定性影响因素试验［14］

　　将脂质体冻干粉针装于透明西林瓶中，充入氮气密封，于不同条件下放置10天，分别于第0，5，10天取样。高温试验条件为40℃；高湿试验条件为相对湿度(RH)92.5％；强光试验条件为4 500 LX的光照。将样品取出后，从以下方面作质量评价：色泽外观、水化难易度、药物含量、过氧化值、包封率。

　　2 结果
　　
　　2.1 制备方法的筛选
　　
　　按“1.3”项下方法制备盐酸伊立替康脂质体，并分别测定包封率：薄膜分散法、逆相蒸发法、pH梯度法、硫酸铵梯度法所测得的包封率分别为10.1%，14.2%，96.8%，97.4%。由结果可知，pH梯度法和硫酸铵梯度法这两种主动载药方法制得的脂质体包封率较高。

　　2.2 硫酸铵梯度法制备处方工艺条件对盐酸伊立替康脂质体包封率的影响

　　2.2.1 外水相除盐方法的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，对除去空白脂质体外水相中的盐这一过程，采用两种方法。①透析法，所用透析袋的截止相对分子质量为12 000；②葡聚糖凝胶柱分离法，所用葡聚糖凝胶为Sephadex G50。分别测定上述两种方法所制得脂质体的包封率，结果显示，透析法包封率为96.8%，凝胶柱分离法包封率97.1%，表明空白脂质体外水相除盐方法对盐酸伊立替康脂质体的包封率影响较小。

　　2.2.2 孵育温度的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，孵育温度分别为15℃，25℃，35℃，45℃，55℃，65℃，75℃，所得包封率结果见图1。如图所示，随着孵育温度的升高，盐酸伊立替康脂质体的包封率不断上升，其中15℃～25℃这一段，脂质体的包封率出现一个突跃，这可能与此时的温度接近磷脂的相变温度有关，因为在主动载药过程中，当环境温度接近或超过磷脂的相变温度时，脂质双分子层的通透性会加大，药物也就更容易依靠梯度的动力跨膜转运。

　　2.2.3 孵育时间的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，孵育时间分别为5，10，15，20，25，30，40 min，所得包封率结果见图2。如图所示，随着孵育时间的延长，盐酸伊立替康脂质体的包封率呈现一个类似线性的上升，这可能提示着药物的跨膜转运是恒速形式的。

　　2.2.4 药脂比的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，药物磷脂质量比分别为1∶3，1∶6，1∶9，1∶12，1∶15，1∶30，1∶40，所得包封率结果见图3。由图可见，随着磷脂比例的上升，包封率呈现较为明显的上升趋势。

　　2.2.5 胆固醇磷脂比的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，胆固醇磷脂质量比分别为1∶3，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，所得包封率结果见图4。由图可见，随着胆固醇比例的下降，脂质体的包封率呈下降趋势，但趋势不甚明显。包封率的下降，可能与在一定含量范围内，胆固醇对稳固磷脂双分子层，防止药物的渗漏起到一定的作用有关。

　　2.2.6 硫酸铵浓度的影响

　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，硫酸铵浓度分别为50，100，150，200，250，300 mmol/L，所得包封率结果见图5。由图可见，随着硫酸铵浓度的上升，脂质体的包封率呈明显的上升趋势，可见硫酸铵浓度的保证，即硫酸铵梯度的维持，对于脂质体的包封率有着很重要的作用。

　　2.3 冻干保护剂的筛选
　　
　　按“1.6.2”项下方法对各冻干保护剂进行考察，结果表明，将蔗糖与乳糖合用，冻干效果最好。因此，选定蔗糖与乳糖作冻干保护剂，并考察不同浓度的冻干效果，结果见表1。由表可见，随着蔗糖和乳糖浓度的上升，冻干效果逐步得到改善，当蔗糖浓度与乳糖浓度都达到5%时，可获得较好质量的冻干粉针。表1 不同浓度蔗糖与乳糖制备得到的盐酸伊立替康脂质体冻干粉针，Tab 1 Lyophilized powder for injection of irinotecan hydrochloride liposomes prepared from different　concentrations of sucrose and lactose（略）。

　　2.4.1 粒径

　　按“1.7.1”项下方法测定粒径，结果显示，脂质体冻干粉针水化后，其数均、体均、强均粒径分别为159.5 nm，169.6 nm和166.8 nm，粒径分布较均匀。

　　2.4.2 稳定性影响因素试验

　　按“1.7.2”项下方法对脂质体冻干粉针的稳定性作各方面考察，结果见表2～4。由表2可知，在40℃条件下，盐酸伊立替康脂质体冻干粉针外观略有变化，水化再分散难度增大，包封率降低，药物含量略降低，表明该脂质体冻干粉针对温度较敏感。由表3可知，湿度对该脂质体冻干粉针稳定性稍有影响。由表4可知，在强光条件下，该脂质体冻干粉针药物含量与包封率降低，表明该脂质体冻干粉针对光照较敏感，其中药物含量降低尤为明显，原因可能为药物本身对光照较敏感。综上所述，本脂质体冻干粉针对温度、光照较为敏感，也易受湿度影响，应低温、避光、密封保存。表2 40℃条件下盐酸伊立替康脂质体冻干粉针稳定性影响因素试验结果，Tab 2 Results of stability test of lyophilized powder for injection of irinotecan hydrochlorideliposomes at 40℃ for 10 days（略）；表3 92.5％相对湿度条件下盐酸伊立替康脂质体冻干粉针稳定性影响因素试验结果Tab 3 Results of stability test of lyophilized powder for injection of irinotecan hydrochloride　liposomes at 92.5％RH for 10 days（略）；表4 4500 LX光照条件下盐酸伊立替康脂质体冻干粉针稳定性影响因素试验结果，Tab 4 Results of stability test of lyophilized powder for injection of irinotecan hydrochloride liposomes
exposed to light(4500 LX) for 10 days（略）。

　　3 讨论
　　
　　对脂质体中的药物进行定量时，须先进行破乳破坏，常用破乳试剂为一些有机溶剂，如甲醇、乙腈、乙醇、DMSO、乙醚、异丙醇、正丁醇等。本试验曾尝试使用上述溶剂进行破乳，结果发现，所用有机溶剂中，极性较高者破乳效果好，但会导致药物峰变形；极性较低者虽不会导致药物峰变形，但在一定倍数体积下，不能完全使脂质体破乳，因而最终放弃了使用有机溶剂破坏囊泡的方法。乳化剂OP（聚乙二醇辛基苯基醚），具有优良的增溶性能，浓度较低时即可使脂质体破乳溶解在溶液中，本试验在乳化剂与脂质体液混合后，采用流动相溶解稀释，这样可以使药物峰不发生变形，且不会出现溶剂峰。回收率试验与加样回收率试验表明，采用OP破乳、流动相溶解、HPLC定量的方法测定脂质体中药物含量的准确度较高。
　　
　　对盐酸伊立替康脂质体制备方法的考察结果表明，主动载药法包封率明显高于被动载药法，原因可能是：①被动载药法的包封率太低。盐酸伊立替康为水溶性的药物，水溶性药物的脂质体普遍存在稳定性差，容易渗漏等问题，而被动载药法为先载药，再通过机械方法调整粒径，因此，即使载药时得到的多室脂质体包封率较高，经过超声，过膜等程序后，脂质体膜遭到破坏，药物可能会发生严重的渗漏，导致最后测得的包封率很低。②主动载药法包封率很高。伊立替康是一种弱碱性药物，很适合用pH梯度法、硫酸铵梯度法等外碱内酸的主动载药法来制备脂质体，由于离子梯度的维持，主动载药法的包封率可以达到很高，因而最终测得的包封率达90％以上。
　　
　　实际使用时，脂质体粉针将被等渗的葡萄糖或氯化钠等注射液稀释，这样，脂质体外水相的渗透压得以与生理渗透压相等，而内水相却始终保持着制备时的渗透压，所以，采用主动载药法制备脂质体时，若内水相渗透压高出生理渗透压很多，实际使用时在注射液稀释过程中或打进人体后，脂质体就有可能吸收大量的水分，发生溶胀破裂，影响制剂的稳定性与治疗效果。因而，采用主动载药法制备注射用的脂质体制剂，如硫酸铵梯度法，内水相硫酸铵浓度的提高虽然有利于显著提高脂质体的包封率，但硫酸铵浓度并不是越高越好，这个浓度有一个上限，若药物的渗透压忽略不计（本研究中药物渗透浓度约2 mmol/L，可忽略），这个内水相硫酸铵浓度的上限就应该是它的生理等渗浓度。

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