脂肪变肝细胞中解偶联蛋白2表达的变化

　　　　 作者：朱亚男， 冯堃， 王炳芳， 何敖林

【摘要】 目的： 探讨解偶联蛋白2（UCP2）在正常肝细胞及不同程度脂肪变肝细胞中的表达情况。方法： 用不同浓度的脂肪乳剂培养肝细胞，使其发生不同程度的脂肪变，作为脂肪变的肝细胞模型。正常细胞作为对照组，另设三组为模型组，其培养液内脂肪乳剂的浓度分别0.5， 1.0，2.0 μl/ml。应用RTPCR技术检测细胞内UCP2 mRNA表达水平，蛋白质印迹检测UCP2的表达情况。结果： 正常肝细胞内可以检测到UCP2 mRNA表达，且随着脂肪乳剂浓度的不断增加，脂肪变肝细胞内UCP2 mRNA相对表达量也增加。模型组与正常对照组表达量差异有统计学意义（P&<0.01），模型组之间的表达量差异也具有统计学意义（P&<0.01）。正常组内未检测到UCP2蛋白，模型组中随着肝细胞脂肪变程度的加重，UCP2蛋白表达也增加（P&<0.05）。结论： 脂肪变性的肝细胞中UCP2表达较正常肝细胞增加，且表达随脂肪变程度的加重而增加。

【关键词】 肝细胞; 表达; 解偶联蛋白2; 脂肪变

　　［Abstract］ Objective: To research the expression of uncoupling protein 2 in normal hepatocytes and fatty liver cells. Methods： Cultured hepatocytes with fatty emulsion， the cells got steatosis to varying degree and made them as the model of fatty liver cells. Normal cells used as control， cultured the model cells with medium containing different concentration of fatty emulsion as follows:0.5，1.0，2.0 μl/ml. Testified the UCP2 expression by RTPCR and Western blot. Results： We verified the normal cells contain UCP2 mRNA， and the higher the fatty emulsion， the more the UCP2 mRNA expression（P&<0.01）. There was no UCP2 protein expression in normal cells， and in model cells the UCP2 protein increased in accordance with the concentration of fatty emulsion（P&<0.05）. Conclusion： The expression of UCP2 in fatty liver cells was higher than normal ones， and there was a positive relationship between the steatosis of fatty liver cells and the quantity of UCP2.

　　［Key words］ hepatocytes; expression; uncoupling protein 2; steatosis

　　非乙醇性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）已经成为威胁人类健康的三大肝病之一，NAFLD通常伴有线粒体功能失调相关的功能基因改变，而解偶联蛋白2（uncoupling protein2， UCP2）是线粒体内膜上的一种转运蛋白，能够解除呼吸链电子传递与ADP磷酸化为ATP之间的偶联，使能量以热能的形式释放掉。动物研究发现高脂饮食喂养的大鼠肝组织内UCP2表达增加，但分离的肝细胞中却未检测到其表达，研究者认为肝组织中UCP2的表达是由于肝旁细胞尤其是库普弗细胞含有UCP2基因［1］。同时又有实验证实小鼠的肝细胞内有UCP2表达［2］，但关于人肝细胞UCP2的表达情况却知之甚少。有研究证实游离脂肪酸可以上调肝细胞内UCP2表达［2］。基于上述研究背景，本实验旨在探讨正常人肝细胞内及经脂肪酸诱导发生不同程度脂肪变性的肝细胞内UCP2的表达情况，为研究脂肪肝时肝细胞的能量代谢及相关损伤提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　人肝细胞株HL7702(上海生命科学院细胞研究所)，胎牛血清(杭州四季青公司)， RPMI1640培养基（Invitrogen 公司），20%脂肪乳剂注射液（华瑞制药有限公司）， UCP2抗体（武汉博士德），鼠抗兔IgG（上海元象公司），Trizol试剂（Invitrogen 公司），cDNA第一链合成试剂盒及PCR反应体系均由上海生工生物工程有限公司提供。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养及肝细胞脂肪变模型的建立　　 HL7702肝细胞株常规培养， 用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度，传代2～3代后，待细胞处于对数生长期时，接种到4个培养瓶中（25 ml玻璃培养瓶），分别标记为1组、2组、3组、正常组。细胞铺满瓶底50%～60%时可换液并施加干预，每组5瓶。正常组仍旧为常规培养液，1组、2组、3组培养瓶中加入20%脂肪乳剂，确保其浓度分别为0.5，1.0，2.0 μl/ml，脂肪乳剂培养48 h后，用油红O染色肝细胞（一种亲脂性染料）。显微镜下观察，染色显示细胞内有不同程度的红色脂滴积聚，细胞折光性变弱，在电镜下可以发现发生脂肪变性的肝细胞内折光颗粒增多，说明细胞发生了不同程度的脂肪性损伤，我们前期的实验也证实此种造模方法是可行的，可以作为脂肪变性的肝细胞模型以进行下一步研究［3］。

　　1.2.2 RNA的提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR） ①提取总RNA和逆转录：细胞干预完成后，PBS漂洗两遍，加入Trizol 试剂，提取步骤按说明书操作。提取完成后，紫外分光光度计测定D（260 nm）/D（280 nm）&>1.6， 琼脂糖凝胶电泳显示28S亚基为18S亚基RNA的2倍，说明所提取的RNA质量符合要求。按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。②引物合成：UCP2，GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司设计及合成，UCP2上游引物序列5′CCGGTTACAGATCCAAGGAGAA3′；下游引物序列5′TCAGAATGGTGCCCATCACA3′；PCR扩增产物长度为84 bp。GAPDH 上游引物序列 5′CCACTCCTCCACCTTTGAC3′；下游引物序列5′ACCCTGTTGCTGTAGCCA3′； PCR扩增产物长度为100 bp。③PCR：PCR反应条件94℃预变性4 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 35个循环，最后72 ℃延伸10 min结束循环。PCR扩增的产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子质量比较鉴定。用BioRad凝胶成像系统进行图像分析，用目的基因条带与GAPDH条带光密度值之比来表示目的基因mRNA的相对含量。

　　1.2.3 总蛋白的提取和定量 细胞干预完成后，PBS漂洗两遍，按照总蛋白提取试剂说明书操作，BCA法进行蛋白定量，沸水浴中煮5 min，-70℃保存待用。

　　1.2.4 蛋白质印迹操作分析　　 每泳道上样量为40 μg，用12% SDSPAGE电泳分离蛋白样品， 湿法转印PVDF膜， 5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，一抗(1∶150)稀释，室温杂交1 h，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，用ECL发光液进行显色，胶片曝光显影，BioRad分子成像系统处理。

　　1.2.5 统计学处理 结果用±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，模型组和对照组之间以及对照组之间两两比较采用Dunnettt检验。以上分析用SPSS统计软件进行。P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 正常肝细胞及脂肪变肝细胞内UCP2 mRNA的表达

　　正常细胞内可以检测到UCP2 mRNA表达，模型组UCP2 mRNA表达量明显高于正常组（P&<0.01），且随着脂肪乳剂浓度的递增表达量不断提高（P&<0.01），这表明随着脂肪变的程度加重，肝细胞内UCP2的表达也增加。见图1，图2。

　　2.2 正常肝细胞及脂肪变肝细胞内UCP2蛋白的表达　　正常对照组肝细胞内未检测到UCP2蛋白，而在模型组肝细胞内有该蛋白表达，且表达量随着脂肪乳剂浓度升高而增强（P&<0.05）。这说明正常肝脏的肝细胞内该蛋白不表达或表达甚微，而发生脂肪肝时肝细胞内UCP2蛋白表达增加。见图3。

3 讨 论

　　本实验中用脂肪乳剂诱导肝细胞株发生不同程度的脂肪变性。脂肪乳剂中含有的主要游离脂肪酸是油酸（22%～30%），亚油酸（50%～60%），亚麻油酸（5%～9%）。诸多动物实验证明，肝细胞内UCP2的表达是可诱导的，多不饱和脂肪酸刺激肝细胞表达UCP2的作用明显高于单不饱和脂肪酸。实验所用的脂肪乳剂含有一定量的不饱和脂肪酸。本实验中发现正常的肝细胞中可以检测到UCP2 mRNA但并未发现UCP2蛋白的表达；而脂肪变的模型组细胞内UCP2核酸和蛋白均有表达，而且UCP2表达随脂肪酸浓度的上升而增加。因此我们可以推测在脂肪性肝病发生时，肝细胞内的UCP2表达增加随着脂肪变程度的加剧而不断上升，那么这有何意义呢？

　　UCP2的生理作用主要是减少ATP生成，减少反应性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的产生［4］。近年来UCP2在产热方面与肥胖、糖尿病以及自由基生成调节、神经凋亡、循环高代谢以及免疫疾病、衰老等方面的相关关系受到日益广泛的关注［5］。

　　研究证实，UCP2被一些特异性的因素刺激的时候就会转运质子［6］，多不饱和脂肪酸是最重要的刺激因素。UCP2虽然在细胞内含量甚微，但在白色脂肪组织、脾脏、胰腺等许多组织中均有分布，因此对于机体的刺激产热作用仍是不可忽视的［7］。肝细胞脂肪变时由于UCP2的解偶联，一方面可以使积聚在肝细胞内的脂肪氧化，减少脂质沉积，但同时ATP生成减少，肝细胞能量代谢紊乱，更容易受到炎症因子、细胞毒素等的“二次攻击”。本实验中也发现随着脂肪变程度的加剧，肝细胞的损伤加重，UCP2表达增加，在细胞内到底哪个作用更重要，还需要对脂肪变的肝细胞能量状态作进一步的研究。

　　线粒体是产生ROS 的主要场所，在脂肪性肝病时线粒体有不同程度的损伤和超微结构的改变，表现为肿胀、通透性增加，出现类结晶包含体［8］。本实验中，在电镜下可以发现发生脂肪变性的肝细胞内折光颗粒增多，也许是由于细胞受损的结果。Hong［9］等用过表达UCP2的腺病毒转染胰岛素瘤细胞株，发现UCP2过表达可以促进线粒体呼吸，尤其是显著增加4期呼吸，降低ADP/O 比值，使脂质氧化为CO2从而降低ROS和LPO 生成。ROS的生成是线粒体损伤的主要原因，脂肪性肝病时可产生更多的ROS和脂质过氧化物［10］。脂肪肝中的UCP2在特异性的刺激因子（如游离脂肪酸）的作用下通过其温和的解偶联作用，从而减少ROS的生成，减轻了氧化应激对细胞的损伤［5］。

　　在脂肪性肝病时，UCP2表达增加可以减少ROS的生成，降低氧自由基对细胞的损伤，增加了脂肪酸的氧化，减少了脂肪在细胞内的堆积，从而起到保护作用。但UCP2的上调同时也降低了细胞内ATP的水平，增加了肝细胞对损伤的敏感性。在脂肪肝的病理进展过程中UCP2的保护作用和损伤作用的强弱以及肝旁细胞内UCP2的表达情况还需要进一步的研究。

　　本实验中，正常细胞内有UCP2 mRNA却没有检测到UCP2 的蛋白表达。在Rashid 等人的实验中也出现过类似的现象，他们发现，在肥胖小鼠体内可以在核酸水平检测到UCP2基因表达(Northern blot)，同时也检测到UCP2蛋白（免疫组织化学方法）。但是在正常小鼠以及乙醇喂养诱导为脂肪肝模型的小鼠体内，只能在核酸水平检测到UCP2，而蛋白则没有检测到。同时肥胖小鼠的UCP2 mRNA水平也较正常组和乙醇组高很多［2］。这种蛋白与核酸表达不同步的现象可能由如下原因造成：一是正常细胞生理情况下蛋白水平太低，没有达到现在检测技术能够测定的范围；另一种假设则是，在正常生理情况下UCP2不需发挥作用，表达量很低，只有在特定刺激信号的作用下，如脂肪酸过度堆积时，才会被转录和翻译而发挥作用，脂肪酸不仅在UCP2转录水平起调节作用，而且对翻译的过程也有调控。这些只是猜想，尚需要进一步的研究加以证实。

参考文献

［1］ Nakatani T， TsuboyamaKasaoka N， Takahashi M， et al. Mechanism for peroxisome proliferatoractivated receptoralpha activatorinduced upregulation of UCP2 mRNA in rodent hepatocytes［J］. J Biol Chem， 2002， 277(11):9562-9569.

［2］ Rashid A， Wu TC， Huang CC， et al. Mitochondrial proteins that regulate apoptosis and necrosis are induced in mouse fatty liver［J］. Hepatology， 1999， 29(4):1131-1138.

［3］ 王炳芳， 朱韶杰， 田培营. 脂肪肝细胞模型的建立及其生物学特性［J］. 世界华人消化杂志， 2007， 15(35): 3674-3677.

［4］ Thompson MP， Kim D. Links between fatty acids and expression of UCP2 and UCP3 mRNAs［J］. FEBS Lett， 2004， 568(1-3):4-9.

［5］ Brand MD， Esteves TC. Physiological functions of the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3［J］. Cell Metab， 2005，2(2):85-93.

［6］ Esteves TC， Brand MD. The reactions catalysed by the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3［J］. Biochim Biophys Acta，2005，1709(1):35-44.

［7］ Arsenijevic D， Onuma H， Pecqueur R，et al. Disruption of the uncoupling protein2 gene in mice reveals a role in immunity and reactive oxygen species production［J］. Nat Genet， 2000， 26(4):435-439.

［8］ Pessayre D. Role of mitochondria in nonalcoholic fatty liver disease［J］. J Gastroenterol Hepatol， 2007，(Suppl 1):S20-27.

［9］ Hong Y， Fink BD， Dillon JS， et al. Effects of adenoviral overexpression of uncoupling protein2 and3 on mitochondrial respiration in insulinoma cells［J］. Endocrinology， 2001， 142(1):249-56.

［10］ Baffy G. Uncoupling protein2 and nonalcoholic fatty liver disease［J］. Front Biosci， 2005， 10:2082-2096.