双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病大鼠C反应蛋白的影响

　　　　　　 作者：段长恩， 黄青松， 孙爱平， 宋向凤

【关键词】 脂磷壁酸； 青春双歧杆菌； 2型糖尿病； C反应蛋白

　　C反应蛋白(Creactive protein，CRP)是肝细胞在IL６等细胞因子作用下合成的一种急性时相反应蛋白，当机体发生炎症、损伤等应激反应时其血清水平急剧升高。研究证实CRP在２型糖尿病患者体内含量较高，且与该病及其并发症的发生、发展关系密切［1］。双歧杆菌脂磷壁酸（lipoteichoicacid，LAT）是一种重要的免疫调节剂，具有抗感染、抗肿瘤、降血脂和延缓糖尿病发生等生物学作用［2］。本实验通过研究青春双歧杆菌脂磷壁酸对２型糖尿病大鼠血清CRP含量和肝细胞CRP mRNA表达水平的影响，探讨其应用在糖尿病预防及临床治疗中的可行性。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 药品试剂及动物
　　
　　链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于Sigma公司；双歧杆菌脂磷壁酸：按乐军等［3］方法从青春双歧杆菌中分离纯化；大鼠C反应蛋白ELISA试剂盒购于上海卓康生物科技有限公司；Trizol，RTPCR试剂盒及DNA标准参照物购于Promega公司。
　　
　　健康雄性SD大鼠30只，清洁级，体质量110～150 g，由本院实验动物中心提供。
　　
　　1．2 分组及实验
　　
　　SD大鼠随机分为正常对照组（对照组），糖尿病组和不同剂量的LAT干预组，每组6只。按照穆松牛等［4］方法制备大鼠2型糖尿病模型：糖尿病组和LAT干预组大鼠饲喂高糖高脂饲料３周后一次性腹腔注射STZ每公斤体质量25 mg(STZ溶于柠檬酸枸橼酸钠缓冲液，所配浓度为10 mg/mL)，３天后以比色法测定空腹血糖值；空腹血糖值≥17.0 mmol/L即为２型糖尿病稳定模型。LAT干预组大鼠分别腹腔注射1.0，2.0，4.0 μg的双歧杆菌脂磷壁酸（LAT溶于5 ml生理盐水中），每天1次；糖尿病组和对照组注射同等剂量的生理盐水，6周后开始实验。
　　
　　1.3 ELISA法检测血清CRP含量
　　
　　大鼠实验前12 h禁食不禁水，处死后心脏取血并分离血清，按照试剂盒说明测定血清CRP含量。
　　
　　1.4 RTPCR法检测肝细胞CRP基因表达
　　
　　分离大鼠肝脏，Trizol法提取肝细胞总RNA。CRP和内参GAPDH引物合成：CRP（326 bp）上游引物：5′TATTTTCTCGTATGCCACCA3′，下游引物：5′TTTCCAATGTCTCCCACCAG3′；GAPDH（541 bp）上游引物：5′TTAGCACCCCTGGCCAAGG3′，下游引物：5′CTTACTCCTTGGAGGCCATG3′。RTPCR法检测CRP基因表达：按照逆转录试剂盒说明进行。取5 μl PCR产物1.5%琼脂糖电泳并用凝胶成像系统检测。
　　
　　1.5 统计学处理
　　
　　样本PCR产物电泳条带灰度分析采用Band Leader 3.0软件，以CRP/GAPDH灰度比值表示CRP表达水平；数值均以±s表示，采用SPSS12.0软件包进行统计学分析，组间比较采用方差分析。
　　
　　2 结果

　　2．1 大鼠2型糖尿病模型
　　
　　糖尿病组和LAT干预组大鼠均出现明显的多食、多饮、多尿、体质量下降症状；比色法测定空腹血糖值均≥17.0 mmol/L。
　　
　　2．2 血清CRP含量
　　
　　糖尿病组和对照组大鼠血清CRP含量分别为(5.67±0.13) mg/L和(1.96±0.13) mg/L，两者间差异有统计学意义(P&<0.05）；LAT干预组大鼠血清CRP含量比糖尿病组低，随LAT浓度增加CRP含量降低，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P&<0.05），结果见表1。
　　
　　2.3 肝细胞CRP基因表达
　　
　　糖尿病组大鼠肝细胞中CRP/GAPDH(灰度比)高于对照组，不同剂量的LAT干预组大鼠肝细胞中CRP/GAPDH(灰度比)均比糖尿病组低，呈浓度依赖性，两组间差异有统计学意义（P&<0.05）；结果见表1，图1，图2。表1 双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病大鼠血清CRP及肝脏CRP mRNA表达的影响（略）。

　　3 讨论
　　
　　糖尿病是由多种原因引起的以慢性血糖升高和（或）伴有多器官系统损害为主要特征的一种内分泌代谢紊乱疾病，其病因与发病机制尚不明确。近年来，炎症学说在2型糖尿病发病进程中的促进作用备受国内外学者的广泛关注［5-6］。
　　
　　本实验结果中糖尿病组大鼠血清内的CRP含量明显高于正常对照组和双歧杆菌脂磷壁酸干预组。CRP作为一种显示系统炎症进展程度的非糖基化聚合蛋白，是炎症急性时相蛋白中最敏感的指标，在多种病理生理过程中起媒介作用［7］。2型糖尿病患者的血清中往往含有多种高水平的炎性细胞因子，它们都直接和（或）间接地促进该病及其并发症的发生，其中以CRP的作用尤为显著［1］。Wang等［8］证实CRP可以通过NFκB途径激活多种炎症相关基因的表达和炎症介质的释放，进而引起血管内皮功能紊乱。CRP可以促进脂类终末产物修饰血管壁蛋白，导致血管壁的增厚和弹性下降，诱发各级血管意外的发生；又可以诱导单核巨噬细胞吞噬脂肪，促进血管动脉粥样斑块的形成并增加斑块的不稳定性［9-10］。越来越多的数据显示：CRP可以作为一种独立于其他糖尿病危险因素的重要前瞻性指标预测2型糖尿病的发生［11］。

　　双歧杆菌是人与动物肠道内的有益菌群之一，对宿主健康起着重要的调节作用。张梅等［12］发现青春双歧杆菌可以通过调节小鼠CD4+，CD8+T细胞亚群从而预防和延迟NOD小鼠糖尿病的发病。孙晶等［13］通过双歧杆菌对小鼠进行灌胃发现其血清中TC，TG的浓度较高脂饮食组显著降低，但是HDLC浓度有所增加。王挺［14］证实双歧杆菌的培养上清可以通过降低D半乳糖小鼠血清内TG，TC含量，延缓其衰老进程。双歧杆菌脂磷壁酸是最初分离于发酵乳酸杆菌的一类含磷酸甘油残基的分子，也是该菌发挥生物学作用的重要表面结构成分［15］。本实验中，腹腔注射青春双歧杆菌脂磷壁酸大鼠的血清CRP含量及肝脏CRP mRNA 的表达水平均明显低于糖尿病组，表明青春双歧杆菌脂磷壁酸可以通过下调糖尿病大鼠肝脏CRP mRNA的表达水平而降低其血清CRP的含量。因此，双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病发病及并发症的预防和治疗具有一定的应用价值。

参考文献

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