缬沙坦对扩张型心肌病大鼠心肌预保护作用机制研究

　　 作者：王罗卿， 张赢予 郭俊芳 莫亚宏， 汪健飞， 张国辉

【摘要】 目的： 探讨血管紧张素Ⅱ1(AT1)型受体阻滞剂缬沙坦对多柔比星诱导的扩张型心肌病（DCM）大鼠心肌预保护作用机制。方法： SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)，DCM模型组(n=20)和预保护组(n=10)。DCM模型组及预保护组予多柔比星（2 mg·kg-1，每周1次）腹腔内注射，正常对照组予同体积生理盐水腹腔注射。预保护组于造模同时给予预保护药物缬沙坦（30 mg·kg-1·d-1）灌胃，DCM对照组与正常对照组给予同体积生理盐水灌胃。8周后取各组大鼠心肌组织测定心肌肌浆网钙泵(SERCA2a)、钙释放通道(RyR2)、受磷蛋白(PLB)、钠钙交换蛋白(NCX1)的mRNA及蛋白表达水平。结果： ①与正常对照相比，DCM模型组SERCA2a，RyR2的mRNA表达水平显著下降（P&<0.05），PLB，NCX1的mRNA表达水平显著上升（P&<0.05）；预保护组SERCA2a，RyR2的mRNA水平均较DCM模型组升高(P均&<0.05)，PLB，NCX1的mRNA水平均低于DCM模型组(P均&<0.05)；②与正常对照组相比，DCM模型组SERCA2a，RyR2蛋白表达水平显著降低(P&<0.05)，PLB，NCX1蛋白表达水平显著升高（P&<0.05）；预保护组SERCA2a，RyR2蛋白水平均高于DCM模型组(P均&<0.05)，NCX1蛋白水平较DCM模型组显著降低(P&<0.05)；预保护组PLB蛋白水平较DCM模型组稍有下降，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论： 预防性给予缬沙坦对扩张型心肌病心肌有保护作用，机制可能与其部分纠正心肌钙调控蛋白的异常有关。

【关键词】 多柔比星； 缬沙坦； 扩张型心肌病； 钙调控蛋白

　　［Abstract］ Objective: To investigate the changes of cardiac function and myocardial constitution in rats with dilated cardiomyopathy(DCM) and whether angiotensin Ⅱ(AT1)receptor blocker， valsartan， has a preprotective effect.Methods： SD rats were pided randomly into 3 groups as follows: control group(n=10)， DCM group(n=20)， preprotection group(n=10).The DCM group and preprotection group were administered by adriamycin injected intraperitonealy at a dose of 2 mg·kg-1 once a week， the same volume of physiological saline was administered in the control group.Valsartan was administered by daily gavage at a dose of 30 mg·kg-1·d-1 in the preprotection group.The same volume of physiological saline was administered in the DCM group and control group.SERCA2a，RyR2，PLB，NCX1 mRNAs and proteins in cardiac muscle respectively were determined in the the 8th week. Results： Compared with the control group， mRNA levels of SERCA2a，RyR2 in the DCM group were significantly decreased(P&<0.05)， which were increased by valsartan treatment（P&<0.05）.The mRNA levels of PLB，NCX1 in the DCM group were significantly higher than those in the control group（P&<0.05）.The mRNA levels of PLB，NCX1 in the preprotection group respectively were lower than those in the DCM group(both P&<0.05).Similarly， protein levels of SERCA2a，RyR2 in the DCM group were significantly decreased（both P&<0.05）， which were increased after valsartan treatment（P&<0.05）.Compared with the control group， protein levels of PLB，NCX1 in the DCM group were increased（P&<0.05）.In the preprotection group protein level of NCX1 was significantly decreased（P&<0.05）.However， protein level of PLB did not differ significantly from that in the DCM group（P＞0.05）. Conclusion： Valsartan given preventive control of dilated cardiomyopathy may be of great significance by partly normalizing mRNA and protein levels of SERCA2a，RyR2，PLB，NCX1 in cardiac muscle.

　　［Key words］ adriamycin; valsartan; dilated cardiomyopathy； calmodulin

　　扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）主要是由于发生重构的心肌功能障碍所致，表现为心肌细胞收缩和舒张的异常。细胞内Ca2+转运过程障碍成为心肌功能异常的主要原因［1，2］。近年来许多研究发现，心肌钙调控蛋白异常是心肌梗死后心室重塑和心力衰竭的重要原因［3，4］。血管紧张素Ⅱ 1(AT1)型受体阻滞剂已广泛应用于DCM心力衰竭，但AT1型受体阻滞剂对纠正心肌钙调控蛋白mRNA水平及蛋白水平的异常，进而改善DCM心功能的具体机制尚有待研究。本实验以AT1型受体阻滞剂缬沙坦预作用于多柔比星诱导的DCM大鼠，测定大鼠心肌组织心肌肌浆网钙泵(SERCA2a)、钙释放通道(RyR2)、受磷蛋白(PLB)、钠钙交换蛋白(NCX1)的mRNA及蛋白表达水平，探讨缬沙坦改善DCM心功能具体机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠，40只，体质量（250±50）g，由江苏大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 试剂 多柔比星（浙江海正药业股份有限公司）；氯胺酮（江苏恒瑞医药有限公司）；缬沙坦（北京诺华制药有限公司）；一抗（SERCA2a，NCX1，RyR2和βactin ）（美国Abcam公司）；Trizol(美国Bipec biopharm公司)。

　　1.1.3 仪器和设备 水平电泳仪、垂直蛋白电泳仪、全自动梯度PCR仪，均为美国Biorad公司产品。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 实验模型制备及动物分组 SD大鼠40只随机分为正常对照组（n=10），DCM模型组（n=20），预保护组（n=10）。DCM模型组与预保护组均给予多柔比星腹腔内注射建模［5］，剂量为2 mg·kg-1，每周1次，共8周。每周根据体质量调整药物剂量，即多柔比星总累计为16 mg·kg-1。正常对照组给予同体积生理盐水腹腔注射。预保护组于建模同时即预防性给予缬沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，共8周，根据体质量调整药物剂量。DCM模型组及正常对照组予同体积生理盐水灌胃对照。于实验第8周后处死大鼠取心肌组织进行相关检测。

　　1.2.2 RTPCR测定心肌钙调控蛋白mRNA Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增SERCA2a，PLB，RyR2，NCX1基因片段。PCR扩增反应条件为：94℃预变性，94℃变性40 s，54℃～59℃退火40 s，72℃延长1 min，共35个循环，72℃10 min。各目的基因和内参基因的引物序列和扩增条件见表1。电泳鉴定PCR产物，凝胶图像分析系统对电泳条带进行密度扫描、观察分析结果。表1 目的基因和内参基因的引物序列和扩增条件

　　1.2.3 蛋白质印迹法测定心肌钙调控蛋白表达 提取左心室心肌组织总蛋白，定量，SDSPAGE，转膜，封闭，抗体杂交，二抗温孵，ECL法显色，曝光，扫描，用Bandscan软件计算灰度值。

　　1.2.4 统计分析 采用SPSS13.0统计软件，结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK法， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况

　　正常对照组、DCM模型组、预保护组8周后存活大鼠分别为10，9和10只。DCM模型组生存率(45%)显著低于预保护组(100%)，P&<0.05，主要死亡原因为心力衰竭。

　　2.2 缬沙坦对心肌钙调控蛋白mRNA的影响

　　与正常对照组相比，DCM模型组SERCA2a，RyR2的mRNA水平显著下降(P均&<0.05)，PLB，NCX1的mRNA水平显著上升(P均&<0.05)；预保护组SERCA2a，RyR2的mRNA水平均高于DCM模型组(P均&<0.05)，PLB，NCX1的mRNA水平均低于DCM模型组(P均&<0.05)。见表2，图1。

　　2.3 缬沙坦对心肌钙调控蛋白表达的影响

　　与正常对照组比较，DCM模型组SERCA2a及RyR2蛋白水平显著降低(P均&<0.05)，PLB及NCX1蛋白水平显著升高(P均&<0.05)；与DCM模型组相比，预保护组SERCA2a及RyR2蛋白水平升高，NCX1蛋白水平降低(P&<0.05)。预保护组PLB蛋白水平较DCM模型组有所下降，但无统计学意义(P＞0.05)。见表3，图2。 表2 第8周各组大鼠心肌钙调控蛋白mRNA表达结果比较表3 第8周各组大鼠心肌钙调控蛋白检测结果

3 讨 论

　　缬沙坦(valsartan)是一种具有特异性、高选择性、竞争性的血管紧张素Ⅱ1（AT1）型受体阻滞剂(ARBs)，在受体水平上高选择、高效地阻断AngⅡ与AT1 受体的结合，从而更完全地阻断AngⅡ介导的生物学效应，抑制AT1受体介导的血管紧张素Ⅱ的缩血管作用，减轻心脏的前后负荷，降低左室舒张末压，改善心脏舒缩功能。

　　SERCA2a具有心脏特异性，主要存在于心肌肌浆网膜上。SERCA2a的主要功能是摄取胞液中的Ca2+进入肌浆网中，使细胞液中Ca2+浓度迅速下降，肌浆网中Ca2+储备上升，心肌舒张，其活性主要受受磷蛋白（PLB）调节。SERCA2a的减少将直接导致心肌细胞质Ca2+浓度下降速度减慢，肌浆网摄取Ca2+减少，并导致肌浆网钙贮存下降。RyR2具有心脏特异性，主要在心肌细胞中表达。RyR2的主要功能是在经LTCC进入心肌细胞内的Ca2+的触发作用下，快速释放大量的Ca2+进入细胞质，触发心肌细胞收缩。RyR2的减少会使RyR2通道对Ca2+内流刺激的敏感性下降，钙释放速度减慢、钙释放量减少。在本实验中，多柔比星诱导的DCM模型组SERCA2a，RyR2在mRNA水平及蛋白水平较正常对照组均显著下降，证明DCM的发生可能与SERCA2a和PLB异常有关。缬沙坦预保护8周后，SERCA2a，RyR2在mRNA水平及蛋白水平均较DCM模型组显著升高，证明缬沙坦对该心肌钙调蛋白的异常有纠正作用。

　　受磷蛋白(PLB)主要作用是调节SERCA2a活性，去磷酸化时与SERCA2a结合，抑制了SERCA2a对Ca2+的亲和力，而PLB磷酸化后与SERCA2a解离，使SERCA2a对Ca2+的亲和力增加。在本实验中，DCM模型组PLB mRNA水平及蛋白水平均高于正常对照组，证明DCM的发生可能与PLB有关。预保护组PLB的mRNA水平与DCM模型组比较显著下降，而PLB蛋白水平虽有所下降，但未达统计学意义。我们分析，虽然PLB蛋白水平下降不明显，但随着SERCA2a表达的恢复，PLB/SERCA2a比率却下降，结果PLB对SERCA2a的抑制作用减弱，从而间接通过增强SERCA2a活性改善钙分布和运转障碍，使心功能得到改善。

　　NCX1主要在心肌细胞中表达，主要功能是进行Ca2+和Na+的跨膜转运。NCX的功能主要受细胞内外Ca2+，Na+浓度和细胞膜电位的调节。大多数研究表明，心力衰竭时，NCX1表达水平显著上升。在本实验中，DCM模型组心肌组织NCX1 mRNA水平及蛋白水平显著上升，证实DCM的发生与NCX1的异常有关。与DCM模型组比较，预保护组NCX1 mRNA水平及蛋白水平均明显下降，心功能得到改善。分析可能原因是：①伴随着大鼠心室肥厚的缓解，心肌细胞体积下降，细胞表面积同体积的比值上升，NCX1需要下调［6］；②随着SERCA2a摄取钙障碍和RyR2舒张期钙漏得到纠正，胞质中钙超载改善，NCX1下调［7］。

　　综上所述，SERCA2a，RyR2，PLB，NCX1异常是扩张型心肌病心力衰竭发病机制之一，这种异常发生在转录和翻译水平。长期预防性应用ARBs类药物缬沙坦可能通过部分纠正心肌钙调控蛋白异常对扩张型心肌病的发生产生预保护作用。

参考文献

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