骨形成蛋白2结合纤维连接蛋白体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的观察

　　　　作者：钱栋 马鹏， 李阳， 陈静， 屈睿， 徐晓峰

【摘要】 目的： 研究骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein，BMP2）和纤维连接蛋白（fibronectin， FN）在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells， MSCs）向成骨细胞分化的能力。方法： SD大鼠的MSCs分离培养后，分为4组:对照组；A组（加入100 μg/ml BMP2）；B组（加入 10 ng/ml FN）；C组（加入100 μg/ml BMP2和10 ng/ml FN），通过检测不同时间点（3，6，9，12天）各组细胞数量﹑细胞碱性磷酸酶(ALP)活性﹑成骨细胞表型以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况，比较分析各组成骨诱导能力的差异。结果： A组、B组和C组细胞形态，成骨细胞表型检测都发生了变化;各组的细胞数和ALP活性随着培养时间的延长而增加，但C组变化最明显，与相同时间点其他各组相比，差异有统计学意义（P&<0.05）。电镜观察发现各组材料上均有细胞生长，但C组细胞的黏附生长状况明显好于其他组。结论： BMP2和FN在体外能明显促进MSCs向成骨细胞分化，两者具有明显的协同效应，可以作为理想的成骨诱导剂应用于组织工程。

【关键词】 骨髓间充质干细胞； 骨形成蛋白2； 纤维连接蛋白

　　［Abstract］ Objective: To study the single and combined effect of bone morphogenetic protein2(BMP2) and fibronectin(FN) on the differentiation of the marrow mesenchymal stem cells(MSCs) into osteoblast cells in vitro. Methods： MSCs obtained from SD rats were cultured，the experiments were investigated into four groups:control normal group;(A)100 μg/ml BMP2;(B)10 ng/ml FN;(C)100 μg/ml BMP2 and 10 ng/ml FN.At different time points(3， 6， 9，12 d)，the numbers of the cells were counted and the levels of alkaline phosphatase(ALP) activity were detected; the expression of osteoblastic phenotypes were demonstrated and the speed of cells growth on nHAC scaffold were also observed by scanning electron micrography(SEM).The differentiation of bone among groups were analysed. Results： After differentiation of MSCs obtained from SD rats. The cells possessed osteoblast morphological properties ;the cell numbers and the expression of the ALP increased with cultivating time of the four groups were all changed between group C and others，and group C were most obviously demonstrated. At the same time point compared group C with other groups，the difference had statistical significance（P&<0.05）. Cells could be observed on every by SEM， the properties of cells in group C had significant change. Conclusion： FN combined BMP2 can effectively induce BMSCs to differentiation and proliferation into osteoblast cells in vitro， It is suggested that interaction between BMP2 and FN can be used as a better inducer for bone tissue engineering.

　　［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein2; fibronectin

　　组织工程学(tissue engineering，TE) 是生物医学工程学的分支，其研究内容主要集中于3个生物要素: ①种子细胞；②细胞外基质替代物支架材料；③生长因子。近年来，利用组织工程技术构建组织工程骨治疗骨缺损是比较有临床应用价值的治疗策略［1］。骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells， MSCs）是起源于骨髓支持结构的成体干细胞，由于这种细胞不但具有一般干细胞所拥有的自我更新、多向分化的特性，而且来源广、取材简便、免疫排斥反应弱、遗传背景稳定，是目前最理想的种子细胞之一［2］。但其在体外的分化方向很大程度上取决于它的诱导条件。骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein，BMP2）能诱导和加速MSCs向成骨样细胞分化［3］。纤维连接蛋白（fibronectin，FN）是和胶原及其他基质结合的重要桥梁，也是细胞扩展优良底物［4］。本实验通过探讨这两种物质的诱导对MSCs的影响，以期找到上述3个生物要素之间的交汇点，为骨组织工程找到较为理想的诱导剂。

1 材料和方法

　　1.1 动物和试剂

　　健康雄性SD大鼠，体质量约150 g，由江苏大学动物实验中心提供；纳米晶胶原基骨（nanoHydroxyapatite/collagen， nHAC）材料（由清华大学材料系崔福斋等人研制）；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；Cy3标记的羊抗兔IgG、hoechst33342（Sigma公司）；兔抗大鼠I型胶原单克隆抗体、羊抗兔IgGHRP(武汉博士德公司)；BMP2，FN（PeproTech 公司）；ECLplus(Amersham 公司)；细胞碱性磷酸酶（ALP）染液、ALP检测试剂盒(南京建成生物工程研究所) 。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SD大鼠MSCs的获得与培养 颈椎脱臼处死SD大鼠，无菌条件下取其股骨、胫骨， 用含体积分数10%胎牛血清的LDMEM培养液冲洗骨髓腔，冲出骨髓，淋巴细胞分离液分离后，小心吸取白雾状的有核细胞层置入另一管中，高糖PBS 洗涤2次。末次离心后，弃上清，加入10%胎牛血清的培养液，调整细胞浓度到2×106/ml，接种于经明胶处理过的25 cm×25 cm培养瓶中，37℃，5% CO2孵箱中培养，3～4 d后首次半量换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3天换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长满至瓶底面积的80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶常规消化，按1∶2比例传代培养。

　　1.2.2 实验分组 对照组:不加BMP2和FN；实验组: BMP2（100 μg/ml）单独作用于SD 大鼠MSCs(A组)；FN（10 ng/ml）单独作用于SD 大鼠MSCs(B组)；BMP2（100 μg/ml）联合FN（10 ng/ml）作用于SD大鼠 MSCs（C组）。

　　1.2.3 FNnHAC的制备 FN(终浓度为10 μg/ml)先溶解于无血清的LDMEM培养液，nHAC切割成5 mm×5 mm×5 mm大小，浸泡于 FN/LDMEM中4 ℃过夜，处理24 h，取出置于24孔培养板中备用。

　　1.2.4 构建组织工程骨 0.25%胰酶消化生长状态良好的第2代SD大鼠MSCs，制成2×106/ml的细胞悬液， 吸取100 μl分别滴加到已置入24孔板的nHAC，FNnHAC材料表面，37℃， 5% CO2，饱和湿度静置2 h后，反转材料，向每组材料另一面滴加100 μl细胞悬液， 37℃， 5% CO2，饱和湿度静置培养2 h后，将（nHAC+MSCs）分为两组，对照组：加单纯LDMEM浸没材料，A组：加含有BMP2(浓度为100 μg/ml)的LDMEM培养液浸没材料；同样将（FNnHAC+MSCs）分为两组，B组：加单纯LDMEM浸没材料；C组：加含有BMP2(浓度为100 μg/ml)的LDMEM培养液浸没材料，置于孵箱中培养。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 增殖细胞计数 取生长状态良好的第2代SD大鼠MSCs，调整细胞浓度到2×106/ml接种于预先置入玻片的24孔细胞培养板上，按实验分组要求加入不同的成骨诱导剂，诱导培养到第3，6，9，12天时，每组各取样本3片，PBS洗涤3遍，0.25%胰酶消化细胞，反复吹打培养板后加入等量含10% FBS的培养基终止消化，取出培养板，培养液离心，制悬，计数。

　　1.3.2 细胞ALP 活性测定 上述计数后的细胞悬液，在冰浴中用超声细胞破碎机处理5次，6 s/次，共30 s。然后1 000 r/min离心5 min，取上清液按碱性磷酸酶试剂盒介绍的方法算出碱性磷酸酶的活性。

　　1.3.3 成骨细胞表型鉴定 24孔板内各组大鼠MSCs经成骨诱导培养7天后，行碱性磷酸酶细胞化学染色，14天后行I型胶原免疫荧光染色、矿化成积钙结节染色。

　　1.3.4 扫描电镜观察 细胞与支架材料联合培养14 d，每组分别取出3块细胞支架复合物，10%的戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察细胞生长情况。

　　1.4 统计学方法

　　数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件中的方差分析进行统计学处理，若有差异显著性再采用SNKq检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 MSCs的培养及成骨诱导

　　培养48 h后，可见有少量贴壁细胞，多为梭形或成纤维细胞样，细胞形态幼小、细短。少数细胞呈扁平多角不规则形态。7天左右细胞可长满瓶底，细胞间排列紧密，均匀一致的长梭形(图1) 。用条件培养基培养3天后，C组细胞的形态和数量发生明显变化，呈多角形，细胞两端有长丝状伪足，且数量增多(图1)。

　　2.2 细胞计数

　　四组细胞随培养时间延长逐渐增多，且相同时间点C组细胞数量最多，对照组最少。其中，C组与对照组、A组、B组之间比较差异有统计学意义（P&<0.05）。具体细胞数见表1。表1 各组培养不同时间细胞计数

　　2.3 细胞ALP活性测定

　　相同时相点C组ALP表达量最高，与其余各组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，见图2。

　　2.4 成骨细胞表型的检测

　　大鼠MSCs经诱导培养7 d后，碱性磷酸酶细胞化学染色A组，B组和C组均呈阳性，C组可见胞质中棕黄色颗粒(图3a)，对照组阴性。诱导培养14 d后， Ⅰ型胶原免疫荧光染色对照组为阴性，A组、B组和C组为阳性，但C组细胞数量明显增多，细胞间融合较好（图3b），A组细胞融合欠佳(图3c)，红色荧光(Cy3)表示Ⅰ型胶原在细胞内的分布，蓝色荧光(Hoechst33342)为细胞核；矿化沉积钙结节染色对照组仍为阴性，A组，B组和C组为阳性，C组细胞间可见红色的钙结节(图3d)。

　　2.5 扫描电镜观察

　　电镜下显示：14 d后可见4组材料上均有细胞生长，细胞在C组的表面和孔隙内生长良好，细胞突起接触融合，细胞密集区域可见到细胞外基质形成，大量细胞形成片状包绕材料表面(图4a)。在B组表面可见细胞黏附，生长良好，但细胞数量少，分泌的细胞外基质相对减少(图4b)。

3 讨 论

　　纤维连接蛋白（FN）是一个150～220 kDa亚单位的二硫键连接的二聚物，是一种重要的桥接分子，可以和胶原、肝素等基质分子结合，也可通过氢键以及范德华力等与材料表面非特异性结合，从而促进细胞和材料的黏附［5］，最新研究表明FN还能促进成骨细胞的生长、分化［6］。

　　在传统的实验中人们更多侧重于其作为细胞外基质蛋白在组织工程构建三维复合支架中所起的作用，而忽视其本身也具有促进细胞增殖和成骨的作用。BMP2属于转化生长因子β超家族成员， 是目前已知的具有最强异位成骨能力的细胞因子［7］，也是骨组织工程中应用最广泛，研究最透彻的诱导剂之一。但是人们把更多的精力放在单纯的研究BMP2在平面环境下促进细胞增殖和成骨的作用，而忽视其在三维空间中促进细胞的黏附。

　　本实验通过平面和三维两种方式结合起来研究MSCs向成骨细胞方向的转化。通过一系列数据的测定并且加以对比，发现在平面环境下BMP2与FN协同效果最佳。经过诱导后，细胞形态由圆形变成多角形，胞体和胞核增大，表现出明显的成骨化趋势，且细胞发生成骨化改变的时间最短。细胞数量和碱性磷酸酶活性表达明显优于其他各组。

　　碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色和矿化沉积钙结节染色成强阳性反应。而在三维支架上，通过电镜扫描发现两者可显著促进细胞在纳米晶胶原基骨支架上的黏附和增殖。BMP2和FN的联合应用原理是:①FN能利用纤维蛋白原和凝血酶的反应制成具有强大黏合力的FN凝块，可在体内快速成型，避免了骨诱导因子流失的问题，因此BMP2与FN的联合应用能在较长时间内维持BMPs 的浓度，避免被血液稀释，能够更好地发挥其成骨效应，同时，FN本身具有促进毛细血管形成的作用，可以加速创伤的愈合［8］。②FN作为细胞外基质蛋白，通过激活信号传导通路，直接影响和调节细胞的成骨化。早期血细胞的植入和相互作用导致血浆蛋白的积累是细胞成骨化的关键因素之一。而且FN血管化可以进一步促进成骨细胞的血管化［9］。

　　现在研究MSCs向成骨细胞转化的诱导剂种类和诱导方式纷繁复杂，众说纷纭。本实验的亮点是通过平面和三维结合的方式来比较不同诱导剂的优劣。不但使其在平面实验中能诱导细胞的成骨和增殖，而且在三维空间里能够更好地黏附在支架上。从而把组织工程学研究的生物要素结合起来，为找到最佳的诱导剂和将来进一步研究奠定坚实的基础。

参考文献

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