【摘要】 目的： 研究镇江地区幽门螺杆菌（H.Pylori）iceA1， babA2基因型分布及其与临床消化疾病的关系。方法： 从70例胃十二指肠疾病患者胃黏膜活检组织中分离培养H.Pylori，PCR扩增检测H.Pylori iceA1， babA2基因型。用χ2检验分析各基因在不同胃十二指肠疾病中的统计学意义。 结果： 70例菌株的总检出率分别为iceA1 68.6%，babA2 65.7%。其中iceA1的分布为胃癌12/14(85.7％)，慢性胃炎18/30(60%），消化性溃疡18/26(69.2%)；而babA2的检出率为胃癌8/14(66.7%），慢性胃炎19/30(63.3%)，消化性溃疡19/26(73.1%）。 结论： 镇江地区分离的H.Pylori的iceA1与babA2基因与胃癌、消化性溃疡、慢性胃炎等疾病类型的发生无显著相关性，但iceA1在胃癌中的检出率高于慢性胃炎与消化性溃疡患者。
【关键词】 幽门螺杆菌； iceA1基因； babA2基因； 上消化道疾病
［Abstract］ Objective: To investigate the distribution of iceA1 and babA2 genes of Helicobacter pyloric(H.Pylori) in Zhenjiang area and the relationship between these genes and clinical gastric diseases. Methods： H.Pylori strains isolated from the patients with different gastric duodenal diseases. The iceA1 and babA2 genotypes were tested by Polymerase Chain Reaction(PCR). The results were analyzed statistically by χ2 test. Results： iceA1 and babA2 were detected in 48/70(68.6%) and 46/70(65.7%) of total 70 H.pylori strains. iceA was detected in 12/14(85.7%) of H.pylori gastric carcinoma patients， in 18/30(60%) of peptic ulcer patients， in 18/26(69.2%) of chronic gastritis patients. babA2 was detected in 8/14(66.7%) of gastric carcinoma patients， in 19/30(63.3%) of peptic ulcer patients， in 19/26(73.1%) of chronic gastritis patients. Conclusion： No association of different clinical diseases with iceA1 and babA2 genotype was detected in patients， while the prevalence of iceA1 isolated from gastric carcinoma patients was higher than that in peptic ulcer and in chronic gastritis patients.
［Key words］ Helicobacter pylori; iceA1; babA2; gastric diseases; gene
据文献报道，全世界超过50%的人有幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.Pylori）感染。其中西方国家感染率25%～50%，发展中国家高达90%［1］。但感染H.Pylori者仅部分出现明显的消化道疾病症状，且感染后可造成慢性胃炎、消化性溃疡和胃恶性肿瘤等不同的临床结局［2］。H.Pylori菌株基因型的多态性可能在其感染后的结局中起一定作用，而H.Pylori毒力因子的不同也是造成不同临床结局的因素之一。不同国家和地区都对H.Pylori的毒力因子与相关临床疾病的关系进行了大量的研究，但结果不一。cagA，vacA，iceA及babA2是国内外报道的H.Pylori的主要毒力因子。大量文章报道cagA是H.Pylori的重要毒力因子，与胃癌和消化型溃疡密切相关［3，4］，vacA基因的序列和长度在H.Pylori菌株间是多变的，由不同等位基因组合而成的vacA基因型与毒力水平相关，与不同的临床结局相关，同时有地区分布的差异［5］。针对江苏省镇江地区（中国东部）的研究报道显示，cagA基因型、vacA基因型检出率在临床胃十二指肠各疾病间差异无统计学意义［6，7］。但该地区的江中岛屿扬中却显示了H.Pylori的高感染率和胃癌的高发病率［8］，这是否与H.Pylori的iceA及babA2毒力因子相关？而有关iceA1和babA2基因型在镇江地区与消化道疾病的关系未有报道。本研究以镇江地区人群为研究对象，探讨H.Pylori菌株iceA1及babA2基因型与上消化道疾病的关系，以期对镇江地区H.Pylori感染的预防和治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 H.Pylori菌株的来源
分离的幽门螺杆菌来自70例2005年7月至2008年11月因消化道症状来江苏大学附属医院消化科胃镜室检查患者的胃窦黏膜（距幽门5 cm以内）活检组织，每例取新鲜胃黏膜3块，其中1块置于输送液中用于H.Pylori 分离培养与胃黏膜DNA提取，1块用于快速尿素酶检测，1块用于病理组织学检查。70例中慢性胃炎30例，消化性溃疡26例，胃癌14例。疾病的诊断依据胃镜和病理学检查。
1.2 H.Pylori的培养与鉴定
自输送液中取出胃黏膜标本，以接种环轻轻将组织置于固体培养基上（4%基础培养基加无菌全羊血及选择性抗生素）反复涂抹后，于37 ℃微氧条件下培养3～5 d，经菌落形态、涂片染色显微镜下观察以及生化反应（尿素酶，氧化酶和触酶）证实。
1.3 基因组DNA提取
按标准PBS/氯仿，异戊醇法抽提基因组DNA［3］。
1.4 引物设计
以已知iceA1基因（登录号AF 459446.1）及babA2基因（登录号AF 033654.1）分别设计引物，引物序列和扩增片段长度见表1。引物均由上海生物工程公司合成。
1.5 PCR反应
PCR总体积均为20 μl。dNTP和Taq聚合酶购自TakaRa宝生物工程（大连）有限公司。反应体系如下：10×PCR 缓冲液 2.0 μl，Taq酶0.3 μl，P1 引物 0.5 μl，P2 引物 0.5 μl，cDNA 1 μl，dNTP 2.0 μl，ddh3O 14.7 μl。iceA1扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，53.7 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。babA2扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，57.7℃ 40 s，72 ℃ 45s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应在BroRad公司的MyCyer PCR仪上进行，以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送上海英骏生物技术工程有限公司测序，测序结果与PubMed 上公布的H.Pylori序列进行对比分析。表1 iceA1和babA2基因的PCR引物
1.6 统计学分析
SPSS13.0统计软件进行χ2检验。
2 结 果
2.1 扩增结果
iceA1和babA2获得目的大小的PCR产物（图1和图2）。
2.2 iceA1及babA2基因的检出率
镇江地区iceA1， babA2基因型检测结果显示，70株H.Pylori中iceA1总阳性率为68.6％，babA2总阳性率为65.7％。iceA1， babA2在不同疾病的基因检出率见表2。结果显示在各组疾病之间的iceA1检出率以及babA2基因型的检出率均无显著性差异（P&>0.05）。但iceA1在胃癌中的检出高于慢性胃炎及溃疡组。表2 iceA1和babA2在临床消化疾病中的检出率 例
3 讨 论
iceA是人们新近发现的H.Pylori的一毒力基因，是Peek等［4］在比较两株分离自溃疡和胃炎患者的H.Pylori的mRNA转录时发现的，当H.Pylori与胃上皮细胞接触后可诱导iceA基因的表达，所以该基因被命名为接触诱导基因。iceA有iceA1与iceA2两个等位基因。Donahue等认为iceA1在大部分H.Pylori菌株中并不是编码一个功能蛋白，而是在转录水平调节其下游hpyⅠM基因的表达，通过DNA甲基化水平的改变来调控相关毒性基因的表达，从而间接参与H.Pylori的致病作用。iceA等位基因在世界各地的分布各有不同，美国和哥伦比亚以iceA2为主，日本和韩国以iceA1为主，国内浙江、上海、西安等地区以iceA1为主。欧美的一些研究发现携带iceA1的H.Pylori菌株与消化性溃疡和胃黏膜IL8水平有显著相关性［9］，而IL8与IL6，IL1β，肿瘤坏死因子（TNF）α等细胞因子，均参与胃癌的发生［10，11］。本研究显示镇江地区的iceA1总检出率为68.6%，在胃癌中的检出率（85.7%）高于慢性胃炎和消化性溃疡疾病（分别为60%，69.2%），在消化性溃疡中检出率高于慢性浅表性胃炎，但无统计学意义。
H.Pylori的黏附素的特性使H.Pylori免于被胃蠕动、胃排空等力量排出体外，是H.Pylori定居、生存及致病的必要条件，Hp通过直接分泌毒素和间接诱导免疫反应而导致上皮损伤。babA是迄今为止唯一明确受体的H.Pylori黏附素，它能够与胃上皮细胞表面的血型抗原Lewis b结合而介导H.Pylori与胃上皮细胞的黏附。babA有两个基因型：babA1与babA2，两者序列高度同源，但只有babA2具有功能活性［12］。世界各地对babA2的报道各不相同，巴西该型基因阳性率44%，与消化性溃疡有关；日本babA2阳性率89%，与临床无关。国内浙江地区阳性率81.4%，与疾病类型无关系。本研究中镇江地区H.Pylori菌株中babA2阳性率66.1%，未发现与疾病类型有关系。
根据上述研究我们知道，镇江地区分离的H.Pylori的iceA1与babA2基因与胃癌、消化性溃疡、慢性胃炎等疾病类型的发生无显著相关性，各国、各地区对H.Pylori毒力各因子的致病性及其与临床疾病的相关性的报道也各不相同。现有文章报道H.Pylori几种基因协同作用更能够加重胃黏膜疾病，甚至可能导致胃癌［13］。西方国家的研究显示vacAsl/cagA+基因型与十二指肠溃疡有显著的相关性，cagA，vacAs1 m1和iceA1基因均阳性的感染患者的胃黏膜DNA损伤程度较单一基因阳性的患者严重［14］。我们发现来自3例恶性度较高的黏液腺癌的H.Pylori菌株在培养时生长更好，基因型检测均为cagA+/vacAs1am2/iceA1/babA2/ure阳型，且患者嗜好高盐饮食，与镇江扬中地区居民的嗜好腌制品的高盐饮食习惯相同，与高盐饮食和H.Pylori之间有协同作用，会增加发生胃癌风险的观点相符［15］，也提示H.Pylori的基因之间存在某种关联，存在协同致病作用。但由于临床胃癌的病例数较慢性胃炎和消化性溃疡要少，且从胃癌患者的胃黏膜培养H.Pylori的获取率也较慢性胃炎及消化性溃疡患者低，因此我们研究中胃癌病例数目少，镇江地区iceA1与胃癌相关性以及H.Pylori多基因协同致病作用还有待更大样本进一步研究。H.Pylori的确切致癌机制还不是很清楚，感染后的不同表现，与菌株的毒力差异、宿主、环境众多因素有关，需要进行进一步的研究。
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