褪黑激素对慢性应激性抑郁症大鼠前脑皮质BDNF,TrkB表达及认知行为的影响

　　　　 作者：张大鹏， 许豪勤， 陈 艳， 许 庆， 张 晔， 徐金， 周志强， 刘益仁， 狄荣科

【摘要】 目的： 通过观察慢性应激对大鼠认知行为的变化和前脑皮质BDNF，TrkB表达的影响，探讨褪黑激素抗抑郁作用及其机制。方法： 60只SD大鼠，分为5组: 空白对照组、模型对照组、褪黑激素治疗Ⅰ～Ⅲ组， 每组12只。采用慢性轻度不可预见性应激和孤养方法制作抑郁症模型，腹腔注射褪黑激素加以干预， 以“T”型迷宫试验和开场试验观察实验前后动物学习记忆能力和探究行为的变化，用免疫组化法测定前脑皮质BDNF，TrkB的表达。 结果： 应激刺激后，“T”型迷宫试验中模型对照组的错误次数多于空白对照组（P&<0.01）和褪黑激素治疗组（P&<0.01），开场试验中模型对照组的水平和直立活动次数少于空白对照组（P&<0.01）和褪黑激素治疗组（P&<0.01/P&<0.05）。前脑各层面皮质均可见到BDNF，TrkB染色阳性细胞，模型对照组阳性细胞及其灰度少于空白对照组和褪黑激素治疗组（P&<0.05/P&<0.01），褪黑激素治疗组则多于空白对照组（P&<0.01）。结论： 褪黑激素能有效地促进前脑皮质神经元表达BDNF，TrkB，推测褪黑激素可能通过增强神经营养素，从而起到抑制抑郁症发作的作用。

【关键词】 抑郁症; 褪黑激素; 慢性轻度应激; 脑源性神经营养因子; 酪氨酸激酶B

　　［Abstract］ Objective: To explore the antidepression effect and its mechanism of melatonin (MT)， the changes of cognitivebehavior and expressions of BDNF and TrkB in rat cerebral cortex with chronic stress depression.Methods： Sixty SD rats were pided into five groups: blank control group， depression model control group， MT treated groups ⅠⅢ. The depression model was induced by the chronic unpredictability mild stress (CUMS) and isolated breeding. The depression model rats were treated with melatonin by intraperitoneal injection after chronic stress stimulation. Before and after the experiment， Ttype labyrinth test and Openfields test were used for observation of learning and memory and changes in explored behavior in animals. The expression level of BDNF and TrkB in cerebral cortex was analyzed by immunohistochemistry determination. Results： After chronic stress stimulation， the fault frequency of the Ttype labyrinth test in depression model control group was more than that in the blank control group (P&<0.05) and MT treated groups (P&<0.01). The activity frequency of the openfields test in depression model group was less than that in the blank control group and MT treated groups. BDNF and TrkB positive cells were observed in each section of cerebral cortex of rat′s forebrain， but the numbers of positive cells and their gray scales on the depression model control group were less than those in the blank control group and MT treated group. Moreover， compared with those indexes， MT treated groups were more than those in the blank control group. Conclusion： Melatonin can be effective in promoting neurons of cerebral cortex to express BDNF and TrkB. Melatonin can relieve the injury from the chronic mild stress stimulation by enhancing the nervous protection of nutrients to play the role of antidepressant.

　　［Key words］ depressant; melatonin; chronic mild stress; brainderived neurotrophic factor (BDNF); tyrosine kinase B (TrkB)

　　目前对抑郁症的发病机理知之甚少，有研究［1］认为抑郁症与脑内一些神经递质水平的变化有关，长期慢性的生活应激性事件是抑郁症明显的诱发因素。Smith等［2］发现急慢性应激使大鼠海马等脑区细胞脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor， BDNF)表达降低和神经元受损，提出神经营养和神经可塑性受损学说。临床研究［3］发现某些精神分裂症患者和抑郁症患者存在松果体功能紊乱和褪黑激素（melatonin，MT)水平降低的现象，季节性抑郁症与褪黑素的关系已得到许多学者的证实［4］。周志强等［5］先前用褪黑激素治疗大鼠实验性帕金森病，我们应用褪黑激素干预慢性轻度应激性抑郁症（chronic mild stress depressant， CMSD)的发生，观察其对大鼠的学习记忆能力和探究行为的影响，测定大鼠前脑皮质BDNF及其受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B， TrkB)表达的变化，以期探讨褪黑激素抗抑郁作用及其机制。

1 材料与方法

　　1.1 动 物

　　雄性SpragueDawley (SD)大鼠60只，体质量250～310 g，由江苏大学实验动物中心提供。动物自由进食饮水， 光照12/12 h明暗交替，室温饲养。分为5组，每组12只：空白对照组、模型对照组、褪黑激素治疗Ⅰ～Ⅲ组。所有动物在实验前行“T”形迷宫试验(Ttype labyrinth test)，每只大鼠走迷宫3次，计算平均错误次数，测定大鼠学习记忆能力。开场试验(openfields test)观察大鼠5 min内行为，主要包括：水平运动次数、直立运动次数。由3位观察者同时记录，盲法评定，选择得分相近的大鼠进入实验。实验后用上述同样方法测定大鼠的学习记忆能力和探究行为的变化。

　　1.2 模型建立

　　慢性轻度不可预见性应激（chronic unpredicative mild stress， CUMS）抑郁症模型的制备参照文献［6］并加以修改，采用慢性轻度应激和孤养抑郁方法，包括以下几种应激因素：①24 h昼夜颠倒，②禁食24 h，③禁水24 h，④50℃高温环境持续5 min，⑤4℃冰水游泳持续3 min，⑥夹尾2 min，⑦塑料异味24 h，⑧短时足底电击。随机抽签顺序，不可预测，每种应激因素平均重复应用3次，共持续24 d。除空白对照组分2笼群饲养外，其余均单只饲养。

　　1.3 褪黑激素治疗

　　于每日18：00～19：00进行应激试验，20：00进行治疗。褪黑激素治疗组动物分别腹腔注射褪黑激素1.0，5.0，10.0 mg/kg，连续治疗24 d；模型对照组和空白对照组腹腔注射1 ml生理盐水。褪黑激素为Sigma公司产品，使用前先用无水乙醇溶解，然后加生理盐水稀释， 无水乙醇浓度小于0.5％ (v/v)。褪黑激素初始浓度为5 mg/ml， 治疗前调至所需浓度（1 ml）。

　　1.4 取材和切片制备

　　各组大鼠分别于治疗24 d后用乙醚麻醉，0.9%生理盐水250 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4%低聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)300 ml灌注。取右侧脑， 10%低聚甲醛固定48 h以上。以松果体为标志，向头侧横向切取3段，每段厚2 mm。石蜡包埋，连续切片，片厚10 μm， 取3套切片，分别用于HE染色，BDNF，TrkB免疫组织化学染色。

　　1.5 BDNF，TrkB免疫组织化学染色

　　采用SP染色法，兔抗鼠BDNF，TrkB抗体及生物素羊抗兔IgG购于武汉博士德生物技术公司。切片脱蜡后，用3%甲醇过氧化氢孵育20 min，将切片置于10%牛血清白蛋白30 min，分别在切片上加入BDNF，TrkB（1∶200）抗体，在37℃温箱内过夜。次日加生物素IgG（1∶100），37℃反应30 min。用0.1 mmol/L PBS（pH7.4）充分洗涤，DBS/h3O2显色，常规脱水，透明和封固，光镜观察。

　　1.6 图像分析及统计学处理

　　各组连续切片，相同断面皮质区选取3张切片，每张切片随机选取3个视野，用CMIAS 98彩色病理图像分析系统进行分析，0.5 mm×0.5 mm计数器计数BDNF，TrkB染色阳性细胞数及平均灰度值。实验数据应用SPSS统计软件处理，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。

2 结 果

　　2.1 褪黑激素对大鼠认知能力的影响

　　经24 d慢性应激刺激，模型大鼠出现不同程度的动作迟缓、震颤、竖毛，对外界刺激反应低下，兴趣和快感缺乏。褪黑激素治疗组认知能力无明显改变，应用“T”型迷宫试验计数错误次数（表1）。模型对照组应激后错误次数明显增加（150.0%），与空白对照组比较差异有统计学意义（P&<0.01）；褪黑激素治疗组应激前后错误次数增加不明显（平均0.5次，35.0%），与空白对照组比较差异无统计学意义（P&>0.05），与模型对照组比较差异有统计学意义（P&<0.01）， 褪黑激素治疗组间差异不明显。表1 大鼠迷宫试验错误次数

　　2.2 褪黑激素对大鼠探究行为的影响

　　经24 d慢性应激刺激后，用开场试验观察实验前后动物行为，比较治疗效果（表2）。模型对照组水平运动和直立运动次数应激后比应激前分别减少49.8%和48.7%，与空白对照组比较应激后运动次数明显减少（P&<0.01）；褪黑激素组应激前后次数减少不明显（P&> 0.05），应激后与空白对照组的运动次数相近（P&> 0.05），比模型对照组次数明显增加（P&<0.01和P&<0.05），褪黑激素组组间差异不明显。表2 大鼠开场试验水平和直立运动次数a：P&<0.01，与空白对照组比较;b：P&<0.05， c：P&<0.01，与模型对照组比较

　　2.3 褪黑激素对前脑皮质BDNF，TrkB表达的影响

　　光镜观察，前脑各断面均可见到BDNF，TrkB染色阳性细胞，多见于皮质Ⅱ～Ⅵ层，染色反应较强，细胞轮廓清晰，阳性颗粒位于胞质和突起内。用图像处理，统计分析各层面BDNF，TrkB染色阳性细胞数及平均灰度值（表3， 图1，图2）。应激后模型对照组BDNF，TrkB染色阳性细胞数较空白对照组明显减少，灰度值较低；褪黑激素治疗组阳性细胞密度和灰度值均较空白对照组增高(P&<0.05)，较模型对照组也明显增高(P&<0.01)。表3 大鼠前脑皮质BDNF，TrkB染色阳性细胞

　　3 讨 论

　　褪黑激素主要由松果体分泌，参与调节睡眠觉醒节律和多种生理功能。近期有研究［7］发现褪黑激素及其受体激动剂有抗抑郁功能，同时有研究者［8］发现抑郁症发作时会呈现褪黑激素分泌量、分泌节律位相及幅度的异常。国内卞茜等［9］的研究也发现首发抑郁症患者在抑郁发作期褪黑激素浓度低于正常人，且显著低于首发精神分裂症患者，经过抗抑郁药物治疗后，褪黑激素浓度明显上升。由此，推测褪黑激素在抑郁症的发病机制中起一定作用，也为抑郁症的治疗提供新的途径。

　　BDNF是神经营养因子家族的重要成员，通过激活其高亲和力受体TrkB，对神经元的生存及活动起重要调节作用。有研究认为［3，10，11］，应激时BDNF及其受体表达因应激的种类、时间及大脑部位不同而不同。当大脑应对急性的或者比较轻微的应激时，机体处于代偿阶段，BDNF表达上调而发挥营养和神经保护作用；当机体处于比较长期的应激或慢性的神经心理应激时，机体处于失代偿阶段，经过一系列中间因子的作用使BDNF表达下调，导致神经细胞凋亡或死亡。Shirayama等［12］对习得性无助和强迫游泳抑郁模型大鼠中脑直接注射BDNF，发现BDNF具有明显的抗抑郁效应。进一步研究表明，BDNF能增强神经元间的突触联系和可塑性，影响长时增强效应及学习记忆功能。

　　慢性轻度不可预见性应激抑郁模型能较真实地模拟抑郁症的某些症状和病因，已成为国内外学者探究抑郁症的发病机制及抗抑郁剂作用机理而广泛应用的动物模型。本文通过建立慢性应激性抑郁症大鼠模型，观察到慢性应激使大鼠学习记忆能力与探究行为活动明显下降，同时检测到慢性应激致大鼠前脑皮质细胞BDNF，TrkB的表达减少；应用褪黑激素对慢性轻度不可预见性应激性抑郁进行干预，大鼠学习记忆能力明显提高与探究行为活动明显增多，相应地前脑皮质BDNF，TrkB的表达上调。本文结果提示，慢性应激时前脑皮层神经细胞BDNF，TrkB的表达减少，可能是神经细胞可塑性下降、细胞凋亡与再生平衡失调的原因之一，进而导致局部性结构和功能障碍，引起认知、情感等改变。褪黑激素能有效地促进前脑皮质细胞表达BDNF，TrkB，推测BDNF与TrkB特异性结合，激活神经细胞内的保护性信号通路，从而减轻应激造成的细胞损伤，起到抗抑郁的作用。

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