X射线对肺癌细胞DNA修复基因XRCC1表达水平的影响

　　　　作者：史卫林 李坚， 陈萍， 戴春华

【摘要】 目的： 研究X射线对肺癌细胞X线修复交叉互补基因1(Xray repair cross complementing gene 1，XRCC1)表达的影响，探讨DNA碱基切除修复机制在肺癌细胞对放疗耐受中的可能作用。方法： 以噻唑蓝还原法(MTT)检测X射线对肺癌细胞（人肺腺癌细胞株 A549）抑制率的影响，实时荧光定量PCR技术检测X射线处理后肺癌细胞XRCC1 mRNA的表达水平。结果： 肺癌细胞抑制率多数情况下随X射线照射时间的延长及照射剂量的增大而增加，呈照射时间依赖性(P＜0.05)和剂量依赖性(P＜0.05)；X射线照射后肺癌细胞XRCC1 mRNA的表达水平均先增高后降低，4 Gy组和8 Gy组在72 h表达水平最高(P＜0.05)，16 Gy组和32 Gy组在48 h表达水平最高(P＜0.05)。结论： X射线照射可引起肺癌细胞XRCC1 mRNA表达水平的明显改变，提示DNA碱基切除修复机制可能在肺癌细胞对放疗的耐受中起了重要的作用。

【关键词】 肺癌细胞； X射线； 抑制率； X线修复交叉互补基因1

　　［Abstract］ Objective: To study the effect of Xray on expression levels of Xray repair crosscomplementing gene 1(XRCC1) in lung cancer cells， and explore the effect of DNA baseexcision repair mechanism in the resistance to radiotherapy of lung cancer cell.Methods： Cell inhibition ratio was measured using MTT assay.The expression level of XRCC1 mRNA was measured by RFQPCR assay. Results： In the majority， the rate of proliferation inhibiting of lung cancer cells was increased along with the radiation time of Xray prolonging(P＜0.05) and the increase of radiation dose(P＜0.05).The expression level of XRCC1 mRNA in the lung cancer cells was increased significantly after treatment with Xray， and then decreased.The highest expression levels of XRCC1 mRNA of 4 Gy group and 8 Gy group were at 72 h(P＜0.05)， and the highest expression levels of XRCC1 mRNA of 16 Gy group and 32 Gy group were at 48 h(P＜0.05) after treatment with Xray. Conclusion： Xray had a fairly obvious function to decreases proliferation of lung cancer cell， and it could induce the increase of the expression levels of XRCC1 mRNA in lung cancer cells.The results suggest that DNA baseexcision repair mechanism may play an important role in resistance to radiotherapy of lung cancer cell.

　　［Key words］ lung cancer cell; Xray; inhibition ratio; Xray repair cross complementing gene 1

　　肺癌是当今全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%～90%，其中约45%的NSCLC患者在确诊时已属于局部晚期（ⅢA和ⅢB期）。放疗联合化疗是治疗局部晚期NSCLC和其他原因不能手术的早期NSCLC患者的主要手段，其中放疗在强化局部肿瘤控制，防止局部复发中具有重要的作用。放射线引起DNA损伤包括碱基损伤、单链断裂（singlestrand breaks，SSB）、双链断裂（doublestrand breaks，DSB），DNADNA交联和DNA蛋白质交联等损伤［1］。双链断裂是DNA的致死性损伤，但在电离辐射的作用下，更多的是碱基损伤和单链断裂，这种损伤修复需要通过碱基切除修复(baseexcision repair， BER）途径。Xray repair cross complementing gene 1(XRCC1)是碱基切除修复和单链断裂修复途径中一个重要的DNA损伤修复基因，其编码产物作为脚手架蛋白，通过直接与聚合酶β，DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶 （PARP）形成复合物，共同参与修复因电离辐射和氧化损伤引起的碱基损伤和单链断裂［2］，而且在该过程中可能起重要作用。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测肺癌细胞经X射线处理后 XRCC1的表达水平，探讨DNA碱基切除修复机制与单链断裂修复机制在肺癌细胞对放疗发生耐受中的作用。

1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器

　　DMEM培养基，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，Clinac 600c 6 MV X射线(Varia公司)，噻唑蓝，二甲亚砜(Amresco公司)，倒置式生物显微镜（TE300， Nikon)，HT2型酶标仪(Austria公司)，Trizol试剂盒（Invitrogen公司)，RevertAid试剂盒(Fermentas公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(Toyobo公司)，荧光定量 PCR分析仪(Stratagene公司)，人肺腺癌细胞株 A549由江苏大学生命科学院提供。

　　1.2 细胞抑制率的测定

　　取处于对数生长期的 A549细胞，胰酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数。用培养基调整其浓度至 5×103/ml，每次取200 μl接种至 96孔板， 置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育 24 h 后分别用6 MV X射线照射。按照射剂量分4组，分别为4，8，16，32 Gy，并设对照组（不照射线）和空白组（仅DMEM培养基），时间设4个点，为细胞照射后24，48，72，96 h，每组设6个复孔，分别用MTT法检测细胞抑制率。在相应时间，于每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，培养4 h后吸尽培养液，加入二甲亚砜 150 μl/孔，震荡 10 min，在酶标仪上于492 nm波长处测光密度(D)。用空白组调零后，计算各组细胞抑制率（细胞抑制率=1-实验组D/对照组D×100 %）。

　　1.3 实时荧光定量PCR法测定各组XRCC1 mRNA的相对表达水平

　　1.3.1 细胞培养 消化、收集对数生长期的细胞， 按每瓶2.5×104个细胞接种36瓶5 cm×5 cm培养瓶， 置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后分别用6 MV X射线照射。按照射剂量分为4组（4，8，16，32 Gy），并设对照组，每组4瓶。在相应时间点（24，48，72，96 h）消化，收集细胞。

　　1.3.2 总RNA抽提 在收集的细胞中加入1 ml Trizol，反复吹打混匀，室温放置 5 min；加入氯仿200 μl，剧烈振荡15 s，室温静置3 min，4℃ 12 000×g离心15 min；取上清液用等量异丙醇沉淀，室温平衡10 min， 4℃ 12 000 g离心10 min，弃去上清；加入1 ml 70%的乙醇，4℃ 7 500 g离心5 min，弃上清，重复一次；吹干沉淀中的乙醇，加入20 μl DEPC水溶解RNA；通过紫外分光光度计测定RNA的纯度并定量。

　　1.3.3 cDNA的合成 取总 RNA 行逆转录，逆转录体系及过程为：1 μg RNA，1 μl Oligo(dT)18(质量浓度0.5 μg/μl)，DEPC水补至终体积12 μl，混匀，70℃变性5 min，冰上冷却1 min。依次加入5 ×缓冲液4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，RNase抑制剂1 μl 37℃ 5 min，再加入1 μl MMuLV逆转录酶42℃ 60 min，72℃ 10 min后-70℃保存备用。

　　1.3.4 实时荧光定量PCR 引物序列应用生物学软件Primer Premier 5.0 设计，由上海英骏生物技术公司合成。β肌动蛋白：上游引物 5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′，下游引物5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，产物长度250 bp； XRCC1:上游引物5′AGCTGTCGCCATCTGTTC3′，下游引物5′AGCACCCACTCCTTACGC 3′，产物长度370 bp。PCR体系总体积为20 μl，包含cDNA 1 μl，Master Mix 10 μl， 10 μmol/L上下游引物各1 μl，双蒸水补足体系。扩增条件：95℃ 5 min预变性，95℃变性 30 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 40个循环后制作熔解曲线。以β肌动蛋白作为内参照，定量分析XRCC1 mRNA的相对表达水平。目的基因相对表达水平的计算公式：目的基因相对表达水平 2-ΔCT=2-(ΔCT 目的基因-ΔCT 内参基因)。

　　1.4 统计学分析

　　实验重复3次，数据值均以±s表示，应用SPSS11.5统计软件对数据进行分析。运用多因素方差分析进行组间均数比较， P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 X射线照射对肺癌A549细胞的抑制情况

　　　 不同剂量的射线处理肺癌A549细胞后24，48，72，96 h，细胞增殖抑制率与放射性剂量的关系见图1。不同剂量的射线处理A549细胞后，细胞抑制率多数情况下随射线剂量的增加而增加，16 Gy组与32 Gy组比较差异无统计学意义(P=0.211)，其余各组比较差异均有统计学意义（P&<0.05)。各照射剂量组随照射时间的延长，细胞增殖抑制率增加，呈照射时间依赖性(P＜0.05)。＇

　　2.2 XRCC1 mRNA的表达情况

　　采用β肌动蛋白作内参，以校正样品在 RNA提取及反转录过程的误差。实时荧光定量 PCR检测 cDNA中β肌动蛋白表达，每份标本均呈阳性反应，多数Ct值在 18～22之间，说明标本cDNA质量符合要求。标本的扩增曲线和熔解曲线见图2，图3。

　　以反转录的cDNA为模板检测XRCC1 mRNA的表达情况。每份模板中基因的表达量均用β肌动蛋白基因的量进行校正。X射线照射后XRCC1 mRNA的表达水平均先增高后降低，4 Gy组和8 Gy组在72 h表达水平最高，16 Gy组和32 Gy组在48 h表达水平最高，不同时间组，不同剂量组比较均有统计学差异(P＜0.05)。见图4。

3 讨 论

　　　 XRCC代表的是一组 DNA损伤修复基因，包括各种损伤因素引起的多个修复途径中的多个基因。人类XRCC1基因是第一个被分离出来的参与修复离子辐射所致损害的哺乳类动物的修复基因［3］。表面上XRCC1缺乏任何酶活性，但是它被认为是其他修复因子包括DNA连接酶Ⅲ异构体α，DNA多聚酶β，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（APE1），PARP1和PARP2等在发挥DNA修复功能时不可缺少的脚手架蛋白［4-6］。XRCC1蛋白有3个功能区域，分别和不同的酶相互作用。其N端的功能域与DNA多聚酶β结合，DNA多聚酶β催化1～6 nt缺口的填补反应和apurinic/apyrimidinic(AP)位点的5′端磷酸残基的释放，这两个反应均是碱基切除修复中的重要反应步骤［7］。其他两个功能域均为乳腺癌易感基因羧基端(BRCT)结构域。C端的BRCTⅡ域能够和DNA连接酶Ⅲ异构体α(DNA ligase Ⅲα)相互作用，参与DNA碱基切除修复。另一个功能域是居中的BRCTⅠ域，它可以和PARP相互作用。PARP是一种与断裂的单链和双链均有很高亲和力的DNA结合蛋白，并且是DNA末端损伤修复所需的多核苷酸激酶［8，9］。XRCC1的3个功能域的结构和作用提示，XRCC1主要参与 DNA修复反应中的碱基切除修复和单链断裂修复。

　　有研究显示碱基切除修复相关蛋白高表达的细胞对放射线耐受［10，11］，而碱基切除修复缺陷（如XRCC1基因缺陷）的细胞对X射线的敏感性较正常细胞明显增加［12，13］，反映了碱基切除修复能力与细胞对放射线的敏感性相关。我们采用实时荧光定量PCR技术检测了X射线处理后肺癌细胞增殖抑制率及其XRCC1 mRNA的表达水平，不仅显示肺癌细胞增殖抑制基本呈X射线剂量和时间依赖性，而且发现不同剂量X射线照射使XRCC1 mRNA的表达均先增加后降低，4 Gy组和8 Gy组在72 h表达水平最高，16 Gy组和32 Gy组在48 h表达水平最高。这一结果表明X射线在杀伤肺癌细胞的同时也诱导了碱基切除修复途径中相关功能蛋白的基因表达增加，以抵抗X射线对肺癌细胞DNA的损伤作用，证明XRCC1在肺癌细胞对放疗的耐受中可能起着重要的作用。实验中XRCC1 mRNA表达多数情况下呈剂量依赖性，可能是由于随着X射线剂量的加大，DNA损伤加重，肺癌细胞需要加快提高修复损伤DNA的能力。我们的研究结果提示在肺癌的放疗过程中，XRCC1基因有可能作为克服肺癌细胞对放疗耐受而进行治疗的分子靶。已有实验研究显示，通过RNA干扰技术，使XRCC1的表达水平下调，可以在一定程度上提高HeLa细胞对甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate， MMS)的敏感性［14］。可以设想，利用上述技术抑制肺癌细胞XRCC1的表达后，也有可能提高细胞对射线的敏感性，进而增强放疗对肺癌的临床效果。

　　放疗是治疗局部晚期NSCLC和有手术禁忌证的早期NSCLC患者的主要手段之一。因此寻找克服NSCLC细胞对放射线耐受和抵抗的治疗方法，从而提高放疗的临床疗效已经成为一项值得研究的重要课题。本文结果为进一步研究通过抑制肿瘤细胞碱基切除修复途径中的功能蛋白，进而提高肿瘤细胞对放疗的敏感性提供了部分实验依据。

参考文献

［1］ Ward JF， Evans JW， Limoli CL， et al.Radiation and hydrogen peroxide induced free radical damage to DNA［J］.Br J Cancer Suppl，1987，55(8):105-112.

［2］ Kubota Y， Nash RA， Klungland A， et al.Reconstitution of DNA base excisionrepair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein［J］.EMBO J，1996，15(23):6662-6670.

［3］ Thompson LH， Brookman KW， Jones NJ， et al.Molecular cloning of the human XRCC1 gene， which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange［J］.Mol Cell Biol，1990，10(12):6160-6171.

［4］ Caldecott KW， Aoufouchi S， Johnson P， et al.XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase beta and possibly poly(ADPribose) polymerase， and DNA ligase III is a novel molecular ′nicksensor′ in vitro［J］.Nucleic Acids Res，1996， 24(22):4387-4394.

［5］ Whitehouse CJ， Taylor RM， Thistlethwaite A， et al.XRCC1 stimulates human polynucleotide kinase activity at damaged DNA termini and accelerates DNA singlestrand break repair［J］.Cell，2001，104(1):107-117.

［6］ Schreiber V， Amé JC， Dollé P， et al.Poly(ADPribose) polymerase2(PARP2) is required for efficient base excision DNA repair in association with PARP1 and XRCC1［J］.J Biol Chem， 2002， 277(25):23028-23036.

［7］ Wilson SH.Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta［J］.Mutat Res，1998，407(3):203-215.

［8］ Cappelli E， Taylor R， Cevasco M， et al.Involvement of XRCC1 and DNA ligase III gene products in DNA base excision repair［J］.J Biol Chem，1997，272(38):23970-23975.

［9］ D′Silva I， Pelletier JD， Lagueux J， et al.Relative affinities of poly(ADPribose) polymerase and DNAdependent protein kinase for DNA strand interruptions［J］.Biochim Biophys Acta， 1999，1430(1):119-126.

［10］ Robertson KA， Bullock HA， Xu Y， et al.Altered expression of Ape1/ref1 in germ cell tumors and overexpression in NT2 cells confers resistance to bleomycin and radiation［J］.Cancer Res，2001，61(5):2220-2225.

［11］ Herring CJ， West CM， Wilks DP， et al.Levels of the DNA repair enzyme human apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE1， APEX， Ref1) are associated with the intrinsic radiosensitivity of cervical cancers［J］.Br J Cancer，1998，78(9):1128-1133.

［12］ Barrows LR， Paxton MB， Kennedy KA， et al.Characterization of revertants of the CHO EM9 mutant arising during DNA transfection［J］.Carcinogenesis， 1991，12(5):805-811.

［13］ Zdzienicka MZ， van der Schans GP， Natarajan AT， et al.A Chinese hamster ovary cell mutant(EMC11) with sensitivity to simple alkylating agents and a very high level of sister chromatid exchanges［J］.Mutagenesis， 1992，7(4):265-269.

［14］ Luo H， Chan DW， Yang T， Rodriguez M， et al.A new XRCC1containing complex and its role in cellular survival of methyl methanesulfonate treatment［J］.Mol Cell Biol，2004，24(19):8356-8365.