系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞CX3CR1趋化因子受体mRNA的表达

　　　　 作者：李遇梅 姚煦 陈敏 李安生 高建明 杨桂兰 陈志强

【摘要】 目的： 探讨趋化因子受体CX3CR1在系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单一核细胞（PBMC）中的表达，及其与疾病活动的相关性。 方法： 收集93例确诊的SLE患者和30例正常人的PBMC，提取RNA。应用RTPCR方法检测CX3CR1mRNA表达水平，并与疾病活动度评分（SLEDAI）作直线相关性分析。结果： ①CX3CR1 mRNA在PBMC中的表达水平，活动期（3.735±0.557）与非活动期（0.530±0.045），两者差异有统计学意义(t=2.606，P=0.01)；非活动期与对照组（0.146±0.02）间的差异有统计学意义(t=5.831，P=0.000)；患者组（2.819±1.347）与对照组间的差异有统计学意义（t=3.921，P=0.000）。②SLE患者组CX3CR1 mRNA水平与疾病活动度评分(SLEDAI) 呈正相关（r=0.445，t=4.523，P&<0.001）。③不具有血管炎、肌炎、肾损及血小板减少的患者与具有上述相应临床特征的患者比较，CX3CR mRNA表达水平更高，差异具有统计学意义。结论： CX3CR1mRNA表达水平在活动期SLE 比非活动期增高，与疾病的活动性（SLEDAI）呈正相关。CX3CR1可能反映疾病的活动性、参与特异器官受累的发生。

【关键词】 趋化因子受体，CX3CR1；红斑狼疮，系统性；外周血单一核细胞

　　［Abstract］ Objective: To assess the expressions of chemokine receptors CX3CR mRNA on peripheral blood mononuclear cell(PBMC) with active or inactive systemic lupus erythematosus(SLE).Methods： Ninty three definitive SLE patients and 30 controls were collected. PBMC were separated from the peripheral blood specimen. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RTPCR) technique was applied to the semiquantitatively analyze for the expression of chemokine receptors mRNA(CX3CR1) in PBMC. Results： Level of CX3CR1 mRNA expression was significantly increased in patients with SLE（2.819±1.347）as compared with the controls(0.146±0.02)（t=3.921，P=0.000）. Level of CX3CR1 mRNA expression in PBMC showed significantly positive correlation with disease activity(SLEDAI). Conclusion： CX3CR1 might be involved in the pathogenesis of SLE， and the expression level might be a good indicator for the disease activity of SLE.

　　［Key words］ lupus erythematosus， systemic; chemokine receptors， CX3CR1; peripheral blood mononuclear cell

　　CX3CR是CX3CL1型的唯一一个趋化因子fractalkine(分形素、FLK)的特异性受体，FLK的生物学活性是趋化单核细胞和T细胞，促进单核细胞和T细胞与内皮细胞的黏附；趋化NK细胞。FLK可由内皮细胞、成纤维细胞和小胶质细胞表达，当发生炎症时表达上调。CX3CR1在健康人由单核细胞、微神经胶质细胞、自然杀伤细胞及T细胞亚群表达［1］， FLK与CX3CR1结合后可促进单核细胞、NK细胞及T淋巴细胞向上皮细胞、内皮细胞及树枝状细胞的黏附。和其他趋化因子介导的黏附不同的是，表达CX3CR1的白细胞可迅速而紧密地黏附于表达膜结合形式FLK的细胞而无需选择素和整合素的参与，因此FLK及CX3CR1表达的调变可能直接修饰白细胞的黏附和穿行［2，3］。

　　免疫复合物的沉积、淋巴细胞的浸润在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）的发病机制中起重要作用，是造成组织损伤的重要因素，而淋巴细胞的浸润在组织损伤中起主要作用，炎症性趋化因子通过与T细胞趋化因子受体的相互作用而使淋巴细胞聚集。

　　CX3CR1与SLE的关系及其在SLE发病中的作用，鲜见报道。因此我们选取93例SLE患者及30例正常人的外周血单一核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC)检测CX3CR1趋化因子受体mRNA的表达，试图了解其在SLE发病中的表达状态以及与疾病发生的相关性。

1 材料和方法

　　1.1 对 象

　　SLE患者均为我院门诊及住院患者，诊断符合美国风湿协会1982年诊断标准［4］。共收集到临床资料较完整的SLE外周血标本93例，其中女84例，男9例；活动期53例，非活动期40例。患者平均年龄（31.73±1.887）岁（12～59岁）；病程20 d至10年。另以体检正常的30人为对照组，其中男4例，女26例，年龄18～48岁，平均年龄（30.63±1.054）岁。两组在性别和年龄构成上差异无统计学意义。

　　应用SLE疾病活动性指数评分标准进行SLEDAI评分［5］，活动期SLEDAI评分≥8，非活动期SLEDAI评分&<8；以尿蛋白（＋＋＋）以上或尿中有颗粒管型作为肾脏受损的判断标准。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 标本采集 采取SLE患者及正常对照组外周静脉血8 ml，置于15 ml含有1.5％EDTA试管中，待进行单一核细胞分离。

　　1.2.2 PBMC的分离 用淋巴细胞分离液（天津血液病研究所）以密度梯度法分离PBMC。静脉血5 ml，加入1.5% EDTA抗凝管，摇匀；加入等量Hanks液混匀；加入装有等量淋巴细胞分离液的试管中，2 000 r/min，离心20 min，PBMC在淋巴细胞分离液与血浆交界处呈乳白色膜，吸取PBMC于另一试管中，各加入5倍以上pH7.2～7.6的无钙镁Hank′s液，洗2次，1 500 r/min，离心10 min，将所得细胞移入1.5 ml Eppendorff管中，-20℃冻存，待提RNA。

　　1.2.3 提取总RNA 逆转录获得的cDNA的第一条链，应用SuperScriptTM Firststrand Synthesis System (GIBICO/BRL)按试剂盒说明书操作，提取RNA。

　　1.2.4 PCR扩增 引物序列及反应条件如下。CX3CR1：正链5′gtagtgtttgccctcaccaaca3′，反链5′acagcgtctggatgattctgaa3′。片段长度为502 bp［6］。反应条件为：94℃，预变性5 min，38 个循环: 94℃变性30 s; 59℃，退火45 s；72℃，延伸1 min; 最后72℃，延伸7 min。总反应体积为25 μl，取扩增产物6 μl与6×溴酚蓝1 μl混合，上样于2％琼脂糖凝胶中（含溴化乙啶），加入标准分子质量参照物，在0.5×TBE电泳缓冲液中电泳，电压为100 V，60 min。经Gel Doc1000凝胶成像分析系统（BioRad公司）分析。

　　1.2.5 结果分析 用目的条带的峰面积值除以内参照β肌动蛋白的峰面积值，得到目的条带的相对半定量值。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS11.5软件包作统计学分析。用±s表示结果，用t检验或t′检验进行分析，相关分析用直线回归分析法，以积分／CX3CR1作直线回归方程，求相关系数（r）并作显著性检验。

2 结 果

　　2.1 CX3CR1 mRNA在PBMC中的表达水平

　　活动期患者PBMC中CX3CR1 mRNA表达水平（3.735±0.557）与非活动期（0.530±0.045）患者比较，差异有统计学意义(t=2.606，P=0.01)；非活动期患者与对照组（0.146±0.02）间比较，差异有统计学意义(t=5.831，P=0.000)；患者组（2.819±1.347）与正常对照组间比较，差异有统计学意义（t=3.921，P=0.000）。见图1，图2。

　　2.2 SLE患者组CX3CR1 mRNA水平与疾病活动度评分关系

　　SLE患者组PBMC中CX3CR mRNA表达水平与疾病活动度评分（SLEDAI）作直线相关性分析，CXCR3 mRNA水平与SLEDAI（r=0.445，t=4.523，P&<0.001）呈正相关。见图3。

　　不具有血管炎、肌炎、肾损及血小板减少的患者与具有上述相应临床特征的患者比较，CX3CR mRNA表达水平更高，差异有统计学意义。见表1。表1 SLE患者PBMC中CX3CR1 mRNA表达与临床表现及实验室检查相关性

3 讨 论

　　趋化性细胞因子通过与靶细胞膜上相应的趋化因子受体结合，引起靶细胞的定向迁移。迁移是淋巴细胞等免疫细胞完成在炎症组织中的浸润和淋巴细胞再循环的重要基础。已经证实淋巴细胞的迁移主要与趋化性细胞因子有关。白细胞的迁移主要包括与内皮细胞的黏附以及穿过内皮细胞，进入细胞间隙进而到达特定的器官和组织等环节。淋巴细胞与内皮细胞的黏附包括选择素介导的淋巴细胞的滚动，内皮细胞表面趋化性细胞因子与淋巴细胞表面趋化性细胞因子受体结合激活黏附分子，随后是黏附分子介导的牢固的黏附。另外，淋巴细胞的定向迁移也是通过不同组织产生不同趋化性细胞因子发挥选择性的趋化作用实现的。也就是，在穿越内皮细胞时利用一对趋化性细胞因子和其受体的作用，穿越基质时由另一对趋化性细胞因子和受体介导，而到达局部组织时又是通过其他的趋化性细胞因子和受体实现。因而，不同的趋化性细胞因子精确地控制着各种淋巴细胞迁移的各个环节［7］。

　　FLK不仅具有趋化性，同时是黏附分子，表达在内皮细胞上，可由前炎症细胞因子（如IFNγ，TNFα）激活。而FLK受体CX3CR1表达在细胞毒效应淋巴细胞上，包括NK细胞和细胞毒T细胞（包含高水平细胞内穿孔素perforin及granzyme B）及巨噬细胞上。可溶性FLK可引起NK细胞、细胞毒T细胞和巨噬细胞的迁移，但是其膜结合形式可以捕获和增强这些细胞在应答其他细胞因子引起继发性刺激的迁移。此外，通过膜结合FLK激活NK细胞，受刺激后可导致细胞毒性增强，INFγ产生增加。最近研究表明，FLK参与各种临床疾病状态或过程的发生，如动脉硬化症、肾小球肾炎、心脏移植排异反应、HIV感染和类风湿性关节炎［8-11］。

　　Blaschke等［12］分析了FLK在末梢血不同T细胞亚类的表达及其受体CX3CR1在类风湿性关节炎（RA）滑膜的表达，以进一步揭示其在RA中的发病作用。结果显示：FLK主要表达在CD4+T细胞 ，具有Th1型细胞因子表达的特性，在RA滑膜上，巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞和小部分T细胞中可检测到FLK。其受体CX3CR1也在滑膜的巨噬细胞、树突状细胞和T细胞及滑液的成纤维细胞中发现。在体外用FLK刺激，可上调滑膜成纤维细胞MMP2的表达，该趋化因子可能为前炎症因子［12］。在具有干燥综合征的非肥胖型糖尿病鼠模型的涎腺中发现FLK较对照组表达高，且分解为小片段，提示特异性小片段参与自身免疫反应［13］。在Wegener′s肉芽肿患者血浆CX3CL1及单个核细胞中也检测到CX3CR1表达增加［14］。

　　在SLE研究中尚未见有关CX3CR1的报道。本实验中，SLE患者CX3CR1 mRNA表达增高，与疾病评分（SLEDAI）呈正相关；具有血管炎、肌炎、肾损及血小板减少的SLE患者与不具有上述相应临床特征的患者比较，CX3CR1 mRNA表达水平降低，是否提示在SLE患者发病中存在CX3CR1 mRNA表达的异常，CX3CR1参与SLE患者器官的损伤？是否SLE患者PBMC上CX3CR1表达增加，与相应配体FLK结合可引起淋巴细胞的趋化，向特定位置迁移，同时引起细胞因子释放增加，导致局部组织的损伤，在一定程度上参与疾病进展？这些尚待进一步研究证实。

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