PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

　　　　作者：高宇琳， 张海方， 邹 昕， 杜鸿， 夏秋风， 生秀梅， 徐顺高， 黄新祥

【摘要】 目的： 探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法： 应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株；利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异，并选择部分差异表达基因进行RTRCR验证。结果： 经PCR及序列分析证实，伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功；基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调，有22 个基因表达下调。结论： PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用。

【关键词】 伤寒沙门菌； PmrA； 高渗应激； 基因芯片

　　［Abstract］ Objective: To explore the influence of PmrA on gene expression regulation of S. enterica serover Typhi at later stage of hyperosmotic stress. Methods： The pmrA deleted mutant of S. enterica serovar Typhi was prepared by homologous recombination mediated by suicide plasmid. The hyperosmotic stress environment was simulated by increasing the concentration of NaCl in the LB from 50 mmol/L to 300 mmol/L in vitro， and gene expression profiles of wildtype and pmrA deleted mutant of S. enterica serovar Typhi at later stage of osmotic stress were investigated by S. enterica serovar Typhi geneome microarray analysis. RTPCR was performed to prove the results of microarray in some selected genes. Results： PCR and sequencing analysis demonstrated that the pmrA deleted mutant of S. enterica serovar Typhi had been constructed successfully; gene expression profiles analysis revealed that expression of 81 genes and 22 genes were increased and decreased respectively in the pmrA mutant at later stage of hyperosmotic stress. Conclusion： The regulator， PmrA of S. enterica serover Typhi， was important in genes expression regulation in response to hyperosmotic stress.

　　［Key words］ S. enterica serover Typhi; PmrA; hyperosmotic stress; microarray

　　伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi）是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌。目前在沙门菌和埃希菌（Escherichia coli）中已发现数十种双组分调节系统［1］， PmrAB是其中研究较多的一种，属于经典的二元双组分调节系统［2］。目前研究表明沙门菌PmrAB的活化信号主要有高铁离子（Fe3+）、铝离子（Al3+）、酸性pH（如pH 5.5）、钒酸盐［3-5］和低镁离子（Mg2+）［6］， 低镁离子的活化是通过PhoPQ系统促进pmrD的表达来实现的。

　　近年来，基因芯片技术的发展为全面、高效观察基因表达提供了一个极佳的策略。我们利用沙门菌基因组寡核苷酸芯片进行的相关研究表明，伤寒沙门菌在高渗应激的早期（30 min）、中期（60 min）、后期（120 min)与持续稳态高渗（高渗过夜培养）下的基因表达明显不同，许多侵袭相关的基因在高渗应激后期有明显上调，并首次发现在高渗应激后期pmrA的表达明显下调［7］。

　　这些结果提示在高渗应激下伤寒沙门菌的基因表达调节机制十分复杂，存在网络化交叉调节作用，PmrAB系统可能对高渗应激特别是应激后期的基因表达调节有重要的影响。因此，本文利用伤寒沙门菌基因组芯片进行表达谱分析，旨在研究在高渗应激后期PmrA调节因子对其他基因表达调控的影响。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌GIFU10007、大肠埃希菌E.coli SPY372λpir、自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室惠赠；大肠埃希菌E.coli DH5α，E.coli λ372由本室保存。

　　1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH I，Sal I，T4 DNA 连接酶、碱性磷酸酶，ExTaq，TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；胶回收试剂盒为Promega公司产品；荧光染料Cy3，Cy5为Amersham Pharmacia biotech公司产品；总RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；反转录试剂盒为Invitrogen公司产品；伤寒沙门菌基因组芯片由本室研制［8］。

　　1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪(ABI 2700) ；凝胶成像系统(Gene Genius Bioimaging System) ; 电转化仪(BIORAD Gene Pulsero II)；核酸检测仪ND1000 spectrophotometer（NanoDrop ND100）；荧光定量PCR仪（Corbett）；基因芯片扫描分析系统Genepix personal 4100A(Axon Instruments)。

　　1.1.4 引物合成 本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表1。表1 引物序列

　　1.2 方 法

　　1.2.1 PCR引物设计 据NCBI公布的序列信息，在pmrA基因上游和下游设计两对特异性PCR引物P1A/P1B和P2A/P2B（图1），以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出382 bp和722 bp的同源性片段（分别用F1，F2表示）。

　　1-669为prmA基因的编码区，P1A/P1B，P2A/P2B为上、下游特异性引物

　　1.2.2 自杀质粒重组载体的构建 用酚仿乙醇法纯化PCR产物， Sal I消化F1，F2片段后，用T4 DNA连接酶进行定向连接成F1F2片段，用胶回收试剂盒回收后与pMD18T 载体连接，转化至E.coli DH5α，筛选疑似阳性克隆进行BamH I酶切和PCR作进一步鉴定，用碱裂解法提取阳性克隆质粒，用BamH I酶切阳性重组pMD18T质粒，胶回收酶切片段(F1F2)，将其克隆至pGMB151的BamH I酶切位点，用热休克法转入E.coliλ372，筛选疑似阳性克隆并用BamH I酶切和PCR分析鉴定。

　　1.2.3 重组变异株的筛选 参见文献［9］的筛选方法，将连续四次传代完全重组的菌株作为伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株，并经pmrA基因序列分析验证(由上海生工生物技术公司完成)。

　　1.2.4 细菌培养及总RNA提取 在体外模拟高渗应激环境，挑取伤寒沙门菌野生株和pmrA缺陷变异株单克隆分别接种于1 ml低渗（50 mmol/L NaCl）LB培养液中，37 ℃振荡（250 r/min）培养过夜，以1∶100分别转接于30 ml低渗LB培养液中，37 ℃振荡（250 r/min）培养4 h至对数生长期，后转入高渗LB培养液中（300 mmol/L NaCl）同样条件培养120 min（高渗应激）。冰上放置15 min后离心（4 000 r/min， 10 min， 4 ℃），收集菌体。用总RNA提取试剂盒分别提取两者总RNA，并用RNaseFree DNase I（37 ℃ 20 min，80 ℃ 15 min）消化残留的DNA。用核酸检测仪检测RNA，确定其浓度。同时取1 μl进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量。-70℃保存RNA备用。

　　1.2.5 RNA反转录及芯片杂交 各取20 μg RNA用随机引物(N9)和基因组特异性引物(genome directed primers，GDP)［8］及反转录酶（SuperScript III，Invitrogen）进行反转录，同时掺入Cy3/Cy5dCTP标记cDNA。野生株和pmrA基因缺陷变异株的RNA进行反转录时，对cDNA进行配对互标Cy3和Cy5，以消除标记差异。标记产物纯化后与伤寒沙门菌基因组芯片进行杂交（42℃，15 h）。具体方法参照文献［8］。

　　1.2.6 芯片扫描及结果分析 芯片杂交后用生物芯片扫描仪双通道扫描芯片，采用GenePix Pro6.0 软件进行图片处理和数据分析，采用荧光总值对数据进行标准化处理（global normalization），详细操作按文献［8］进行。将平行操作的两张芯片获得的各基因4个荧光信号值用Excel计算野生株和变异株各基因荧光信号比值均值R（A/W），并进一步计算比值对数值［log2 R（A/W）］，以该平均值描述结果。取-1和1作为差异表达（１倍差异）的阈值。

　　1.2.7 RTPCR 采用上述方法提取总RNA，按照反转录试剂盒操作进行反转录。从筛选的差异表达基因中，选取差异均比较明显的两个基因进行RTPCR 验证，引物序列见表1。

2 结 果

　　2.1 伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株的制备

　　以GIFU10007 的DNA 为模板，用特异性引物P1A /P1B和P2A /P2B进行PCR扩增，获得了pmrA基因上、下游同源性核苷酸片段F1(382 bp)和F2(722 bp)(图2a)，并进行TA克隆(图2b)。用碱裂解法提取初筛TA克隆阳性质粒，用BamH I酶切和PCR分析鉴定后，将1 104 bp的F1F2片断克隆至自杀质粒pGMB151的BamH I位点，连接后转化入大肠埃希菌筛选阳性克隆质粒，获得重组F1F2片段的自杀质粒（图2c）。将阳性重组自杀质粒用电击转入伤寒沙门菌野生株GIFU10007，按文献［9］方法诱导重组，并经筛选得到了完全重组菌株，在LB平板上连续传代4次，结果均仅有小片段出现稳定完全重组现象(图2d)，表明伤寒沙门菌pmrA缺陷变异株制备成功。

　　2.2 高渗应激后期野生株和缺陷株基因表达谱差异　　结果显示在高渗应激后期(120 min) 伤寒沙门菌pmrA缺陷株有81个基因表达上调（其中有33个功能尚不明确的基因），22个基因表达下调（包含10个功能尚不明确的基因），详细结果见表2。

　　2.3 RTPCR基因表达差异验证

　　选取两个差异表达基因进行RTPCR验证，结果显示yliC基因上调约2倍，putA基因下调约4倍。这两个基因在mRNA水平上与芯片的差异表达情况相类似，表明芯片结果可靠。见图3。

3 讨 论

　　伤寒沙门菌是一种经消化道感染的重要人类致病菌，可造成严重全身系统性感染伤寒热(typhoid fever)。PmrAB双组分调节系统是沙门菌的一种十分重要的双组分调节系统，参与许多基因的表达调节，其功能主要涉及对脂多糖结构修饰、细菌毒力［10］、对多粘菌素B和抗菌肽耐受等。另外还有一些与脂多糖修饰不相关的基因位点，如dgoA， yibD， aroQ， mig13 和sseJ，这些基因的功能尚不明确。运用全基因组芯片技术对原核生物基因表达谱分析已有许多报道，但在肠道菌高渗应激下基因表达谱分析以及在表达调节机制研究中的应用尚鲜有报道。我室利用伤寒沙门菌基因组芯片进行的相关研究表明［7］，在高渗应激后期伤寒沙门菌pmrA的表达明显下调，推测其在高渗应激后期的基因表达调节中可能发挥一定的作用。

　　本研究进一步观察了PmrA在高渗应激时的表达下调对其他基因表达调控的影响。首先我们利用自杀质粒pGBM151介导的同源重组技术，成功制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株。利用本室现有的伤寒沙门菌全基因组芯片技术平台［8］，体外模拟高渗应激环境，在高渗应激后期对伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株的基因表达谱进行对比分析，结果显示高渗应激后期伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株有81个基因表达上调，有22个基因表达下调。对表达差异的基因，抽选yliC和putA基因进行RTPCR验证，结果与芯片分析结果吻合，表明此次芯片结果较为可信。众多研究表明，PmrAB活化后重要功能就是对细菌脂多糖结构进行修饰。这种修饰是用等份的阳离子屏蔽了磷酸基团，显著地影响了阳离子抗菌肽和多粘菌素B与细菌表面相互静电作用［11，12］，表现为细菌对阳离子抗菌肽和多粘菌素B耐受，也可以逃避巨噬细胞对细菌的吞噬。芯片结果显示与细菌脂多糖结构修饰相关的基因没有明显变化，提示也许在高渗应激后期对细菌脂多糖结构修饰不是PmrAB双组分调节系统的主要功能。此次芯片分析的结果中，差异表达的基因主要涉及ABC转运系统相关蛋白、鞭毛相关蛋白、侵袭相关蛋白、外膜蛋白、酶类及其他调节因子等，这提示PmrAB可能具有相应的调节功能。表2 pmrA缺陷株高渗应激120 min后的差异表达基因

　　结果显示在高渗应激后期两个ABC转运系统中所有基因均表达上调，说明高渗应激后期pmrA表达的下调可能有利于精氨酸和脯胺的转运。沙门菌鞭毛有关的各种基因按调节的层次可将这些基因分为三个级次［13］。这次基因芯片结果显示flgD，flgL和cheB基因表达下调。flgD属于二级基因，FlgD是介导鞭毛弯钩部的组装。flgL属于三级基因，FlgL介导鞭毛弯钩和细丝接合部的组装。结果提示高渗应激后期pmrA表达的下调可能有利于鞭毛的装配及细菌动力的恢复。

　　沙门菌致病岛1（SPI1）主要与细菌对肠黏膜的黏附和侵袭有关。我们前期研究结果显示，在高渗应激后期大多数与细菌侵袭相关的基因表达上调［7］，表明伤寒沙门菌在进入高渗环境后期能通过增强侵袭相关基因的表达来提高侵袭力。sigE位于SPI1，编码蛋白SigE为另一SPI1基因编码蛋白SigD的分子伴侣，SigD与细菌侵袭相关。sigE和sigD两个基因都是通过InvF来激活［14］，此次芯片结果没有观察到invF的变化，可能是在高渗应激后期由其他因子来调节sigE。sigE在pmrA缺陷株中表达上调，表明高渗应激后期pmrA表达的下调可能有利于细菌侵袭力的提高。

　　OmpREnvZ双组分调节系统是研究较多的与渗透压调节有关的系统，OmpR被认为是中央调节因子。研究表明外膜蛋白OmpF是一种膜孔蛋白，在细菌外膜上形成一种特殊蛋白质通道，通过孔径的大小来改变细菌外膜的通透性，其主要受环境渗透压和OmpREnvZ系统调控。低渗时表达量多，高渗时表达量下降［15］。此次芯片分析结果中我们没有观察到在高渗应激后期pmrA缺陷株中ompR的表达有明显改变，但ompF表达明显上调，结果提示高渗应激后期pmrA表达下调也是高渗时ompF表达量下降的原因之一。因此PmrAB和OmpREnvZ在高渗应激作用下可能存在某些交叉调节作用，值得深入研究。

　　总之，本研究结果提示在高渗应激后期伤寒沙门菌调节因子PmrA的表达下降，对多个基因的表达调节有影响，初步说明PmrA在高渗应激后的细菌适应性表达过程中起了一定的作用，对细菌的侵袭力的提高有积极意义。

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