虾青素羟丙基β环糊精包合物的制备与稳定性

【摘要】 　　目的： 研究虾青素羟丙基β环糊精的包合，寻找改善虾青素水溶性和稳定性的方法。方法： 利用紫外光谱法研究水溶液中虾青素和羟丙基β环糊精的包合作用；采用研磨法制备虾青素羟丙基β环糊精包合物，并用红外光谱法验证包合物的形成；于60℃，5 000 lux条件下对包合物进行了稳定性加速实验。结果： 在水溶液中虾青素和羟丙基β环糊精能够形成摩尔比1∶2的包合物，包合后虾青素的溶解度由0.21 mg/L上升到3.74 mg/L，稳定性提高了约20倍。结论： 环糊精包合技术显著提高了虾青素的溶解度和稳定性。

【关键词】 虾青素；羟丙基β环糊精；包合物

　　［Abstract］Objective: The inclusion complex of astaxanthin with hydroxypropylβcyclodextrin was prepared to improve water solubility and stability of astaxanthin. Methods： The inclusion complex of astaxanthinhydroxypropylβcyclodextrin was studied by Ultraviolet Spectroscopy in aqueous solution and prepared by trituration.The formation of the complex was confirmed by IR spectroscopy. The accelerative experiment of stability of the complex was carried out at 60℃， 5 000 lux. Results： The water solubility of astaxanthin was increased from 0.21 mg/L to 3.74 mg/L and the stability was improved almost 20 times by forming 1∶2 inclusion complex with hydroxypropylβcyclodextrin. Conclusion： The solubility and stability of astaxanthin were improved with hydroxypropylβcyclodextrin.

　　［Key words］astaxanthin; hydroxypropylβcyclodextrin; inclusion complex

　　虾青素(astaxanthin， ASX)是一种重要的类胡萝卜素，具有极强的抗氧化性能，有抑制肿瘤发生，增强免疫力，清除体内自由基等多方面的生物学功能［1］，在医药、食品、饲料等工业中具有广阔的应用前景。但虾青素极易被氧化且水溶性差，这些特点严重限制了它的应用［2］。

　　羟丙基β环糊精（hydroxypropylβcyclodextrin，HPβCD）是一种优质的包合材料，能够显著地改善药物的溶解性和稳定性［3，4］。
　　本研究旨在利用HPβCD包合ASX以增加其稳定性，改善其水溶性，为ASX在更广阔领域的应用打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　ASX（&>98%）（Sigma公司）；HPβCD（江苏省泰兴新鑫医药辅料有限公司，平均取代度4.6，平均相对分子质量1 380）；甲醇（色谱纯试剂，Merck公司）；纯净水（自制）；其他所用试剂均为分析纯。Waters HPLC系统（美国Waters公司）；UV2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；60SXRFTIR 红外光谱仪（美国Nicolet公司）； KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司）；SHZD(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ASX含量测定方法

　　1.2.1.1 色谱条件　　

　　本实验采用高效液相色谱法测定ASX的含量， 按照文献［5，6］报道方法，色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(5 μm， 250 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇：水（90∶10）；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；进样量为10 μl；紫外检测器检测，检测波长为 475 nm。

　　1.2.1.2 标准曲线的制作

　　精密称取ASX 4.30 mg，甲醇溶解定容至100 ml，得到储备液。用甲醇稀释储备液配制成0.43，0.86，1.72，3.44，5.16，6.88 mg/L的系列浓度试液， 按上述色谱条件，分别精密注入10 μl至高效液相色谱仪中，记录。以浓度C(mg/L)为横坐标，峰面积A(mAU/min)为纵坐标，求得回归方程。

　　1.2.2 包合比的测定

　　通过摩尔比率法测定包合比［7］。精确称取ASX适量，配制浓度为5×10-3 mmol/L的ASX水溶液，设为A液。称取适量HPβCD，用A液溶解，配制浓度为（1.25～15）×10-3 mmol/L的系列溶液。各溶液超声10 min后在475 nm波长处测定光密度值D。以HPβCD的浓度C为横坐标，以光密度值D为纵坐标作图，所得曲线的转折点处对应的HPβCD和ASX浓度的比值就是包合物的包合比。

　　1.2.3 ASXHPβCD包合物的制备

　　用研磨法，将ASX和HPβCD以适当摩尔比投料，常温下加少量水研磨4 h，然后真空干燥12 h，干燥物用少量乙醇快速洗涤1次，挥干乙醇后得淡紫色粉末。按此法制备3批包合物。

　　1.2.4 包合物的含量测定　　

　　精确称取ASXHPβCD包合物10 mg，溶解在100 ml甲醇中，超声10 min。溶液用0.45 μm一次性针头滤器过滤，滤液稀释后，根据“1.2.1”含量测定方法进行分析。

　　1.2.5 ASXHPβCD包合物的红外光谱扫描验证

　　分别称取适量ASX、HPβCD、ASX、HPβCD的物理混合物(按包合物制备时的投料比)、ASXHPβCD包合物分别与KBr混匀压片，进行红外光谱扫描，扫描范围为500～4 000 cm-1。

　　1.2.6 ASXHPβCD包合物的溶解度测定　　

　　分别称取ASX和ASXHPβCD包合物适量悬浮于4 ml水中，20℃避光超声溶解1 h，形成两者的过饱和溶液。溶液用0.45 μm一次性针头滤器过滤，滤液适当稀释后，根据“1.2.1”含量测定方法进行分析，从而推算出包合前后ASX在水中溶解度的变化。

　　1.2.7 ASXHPβCD包合物的稳定性

　　取适量ASXHPβCD包合物样品于称量瓶中，于60℃、5000 lux条件下进行稳定性加速实验，每隔一段时间测定ASX含量，与原始含量相比得残存率。同时用未经包合的虾青素样品做对照实验，采用“1.2.1”含量测定方法检测ASX含量变化。

　　2 结果

　　2.1 包合比的测定

　　包合比的测定结果如图1所示，溶液中的ASX由于被 HPβCD包合而紫外吸收增强，并在一定的范围内与HPβCD的浓度正相关。当HPβCD浓度为10×10-3 mmol/L时，曲线出现明显的转折，证明溶液中的ASX完全被包合，此时ASX和HPβCD的摩尔浓度比为1∶2。这表明，ASX与HPβCD可能形成了摩尔比为1∶2的包合物。

　　2.2 包合物的制备与含量分析

　　根据包合比测定结果，将ASX和HPβCD按摩尔比1∶2投料制备包合物。为了使ASX包合完全，可采取适当增加HPβCD投料量的方法。分别称取200 mg ASX和1 000 mg HPβCD，制备3批包合物。根据实验“1.2.1”所得校正曲线方程（A=79 066 C＋15 043 r=0.999 9）测定包合物中ASX含量，结果见表1，包合物的制备工艺稳定。（RSD=1.86 %）。表1 包合物中的ASX含量测定（略）

　　2.3 ASXHPβCD包合物的溶解度
　　
　　实验结果表明，ASX和HPβCD 形成包合物后，水溶性显著改善，溶解度由0.21 mg/L上升到3.74 mg/L。

　　2.4 ASXHPβCD包合物的红外光谱分析

　　红外光谱扫描结果如图2所示， ASX分子在1 654 cm-1有较强的吸收峰，是由于C=O键的伸缩振动造成的。1 552 cm-1的峰是芳香族C=C双键的伸缩振动产生的。974 cm-1的峰是C，C共轭体系中C-H的吸收峰。ASXHPβCD包合物与物理混合物图谱明显不同， ASX 1 552 cm-1的吸收峰在物理混合物中仍然存在，而ASX位于974 cm-1和1 654 cm-1处的特征吸收峰在ASXHPβCD包合物图谱中消失，呈现出与HPβCD相似的吸收峰，这是由于客体分子ASX被包合进入主体分子HPβCD的空腔内，并受到强烈的约束。主客体之间借助包括疏水作用力、范德华力、氢键等多种弱的相互作用结合，使客体基团振动减弱。根据图谱推断ASXHPβCD包合物已经形成。

　　2.5 ASX/HPβCD包合物的稳定性研究

　　ASX和ASXHPβCD 包合物的稳定性加速实验结果如表2所示。在60℃，5 000 lux条件下ASX迅速被氧化；而当ASX被HPβCD 包合后，稳定性提高了约20倍。由此可见，环糊精包合技术可显著提高ASX的稳定性，从而大大延长其保存期。

　　3 讨论
　　
　　ASX是一种具有多种重要生物学功能的类胡萝卜素，但目前还未能应用于医药领域。其主要原因可能有两方面：一方面，其药理活性的应用基础研究还比较薄弱；另一方面，药学性质较差，主要表现为溶解度低且光热稳定性差。
　　
　　关于ASX和βCD的包合作用研究已有文献报道［2］，βCD包合能够显著增强虾青素的稳定性，但未能有效改善其水溶性。因此，选择增溶性能更好的环糊精类包合材料HPβCD来改善ASX的药学性质具有可预期的应用价值。表2 ASX与ASXHPβCD包合物的稳定性实验（略）

　　实验表明ASX和HPβCD在水溶液中能够形成包合物，通过摩尔比率实验推测包合比可能为1∶2。ASX是一个具有11个不饱和碳碳双键的长链状分子，分子两端各有一个羰基，这种结构提供了以摩尔比1∶2与HPβCD形成包合物的可能性［8］。
　　
　　本文采用研磨法制备包合物，制备过程简单且不加入有机溶剂。有研究表明［9-11］，有机溶剂小分子可与药物竞争进入环糊精类材料的空腔，甚至会形成药物/环糊精/有机溶剂分子三元包合物，并且无法通过洗涤、减压干燥等纯化步骤将有机溶剂去除，从而造成包合物中有机溶剂的残留，影响包合物的质量。另外，我们认为包合比虽然对包合物制备有理论指导作用，但也不能完全等同于投料比。关于ASX和HPβCD包合物制备的最佳反应条件还需要进一步深入研究。

　　ASX和HPβCD形成包合物后，HPβCD的疏水内腔在分子水平包裹了ASX，其对ASX的空间位阻作用和络合作用显著增强了ASX的稳定性，而HPβCD外部亲水性的基团则大大改善了ASX的水溶性。ASX药学性质的改善为其在医药领域的应用打下基础。

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