江苏镇江地区早发糖尿病家系HNF1α基因突变的筛查

　　　　 作者：王莹，陈军建， 王东， 范昕， 俞力

【摘要】 　　目的： 探讨江苏镇江地区家族性早发糖尿病与年轻起病成人型糖尿病(maturityonset diabetes of the young， MODY)基因(HNF1α)多态性的关系。方法： 收集80个早发糖尿病家系，另选96例非糖尿病者为对照。提取研究对象血DNA，用PCR产物扩增HNF1α基因的所有外显子，将PCR产物直接进行测序，对HNF1α基因多态性进行筛查。结果： 在80例糖尿病家系先证者中筛查到两个编码区的变异：位于1号外显子的Ile27Leu及7号外显子的Leu459Leu变异。Ile27Leu错义突变的基因型和等位基因频率在糖尿病先证者和正常对照者中无显著差别(P&>0.05)。Leu459Leu同义突变仅在1例先证者中被发现，在该家系中与糖尿病共分离。该突变在正常者中未查到。结论： HNF1α基因突变在江苏镇江地区早发家族性2型糖尿病中不起主要作用。

【关键词】 早发糖尿病；青年发病的成人糖尿病； 突变

　　［Abstract］Objective: To investigate the prevalence of mutations of hepatocyte nuclear factor(HNF)1α gene in Jiangsu Zhenjiang families with earlyonset diabetes mellitus. Methods： Eighty pedigrees probands of earlyonset diabetes were collected in Jiangsu Zhenjiang area， who were diagnosed as type 2 diabetes under 40 years old and， at least， another first relatives was diagnosed as type 2 diabetes under 45 years old. Another 96 nondiabetic subjects were enrolled as controls. By PCR， all the exons of MODY3 gene were amplified and PCR products were sequenced to identify the DNA variants. Results： By screening MODY3 gene in 80 diabetic probands， two DNA variants were identified in coding region， including which we found one Ile27Leu missense mutations in exon 1 and one Leu459Leu samesense mutation in exon 7. There were no difference between the Chinese familial earlyonset diabetes mellitus and the normal controls in polymorphism allelic frequency and genotype frequency of the Ile27Leu mutation(P&>0.05). The Leu459Leu samesense mutation was only found in one proband. It was cosegregated in the pedigree′s members and was not found in normal control subjects. Conclusion： No enough evidence demonstrates that the variation in HNF1α gene is the major cause of earlyonset diabetes in Jiangsu Zhenjiang population.

　　［Key words］type 2 diabetes; MODY; mutation

　　年轻的成人发病型糖尿病(maturityonset diabetes of the young， MODY) 是一组单基因突变所致特殊类型糖尿病。

　　目前发现至少6种基因突变可致病，其中HNF1α（MODY3 ）是最常见的一种。由于种族、地域的差异，有关该基因与江苏省汉族人群中早发家族性2型糖尿病患者发病的关系尚未见报道。本研究对江苏镇江地区早发家族性2型糖尿病80个先证者进行HNF1α基因直接测序以了解两者的关系，现报告如下。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象

　　1.1.1 糖尿病组(diabetes mellitus group，DM)

　　2000年1月～2007年12月江苏大学附属医院内分泌科住院及门诊镇江籍患者中选取，共80个家系，符合常染色体显性遗传特征，每个家系都有发病年龄小于40岁的糖尿病患者，不包括临床以酮症酸中毒起病即需持续应用胰岛素治疗和(或) 胰岛β细胞自身抗体GAD，IAA阳性患者家系和线粒体tRNAleu(UUR) 基因nt3243A →G突变糖尿病家系。

　　1.1.2 正常对照组

　　2005年及2006年份江苏大学附属医院健康体检及献血者中随机选取96例(男46例，女50例)镇江籍非糖尿病者，选取无亲缘关系、口服葡萄糖耐量实验证实血糖正常(空腹PG&<6.1 mmol/L，2 hPG&<7.8 mmol/L) 、体质量指数小于25 kg/m2 、无血脂紊乱(TG&<1.7 mmol/L，HDLC&>0.91 mmol/L) 、无高血压(&<140/90 mmHg)，且无糖尿病家族史者。两组资料见表1。表1 研究对象一般情况（略）

　　1.2 方法

　　1.2.1 生化指标测定

　　测定口服75 g葡萄糖0，2 h血浆葡萄糖、胰岛素，测定血胆固醇，三酰甘油，高密度及低密度脂蛋白，糖化血红蛋白(HbAlc）。血糖的测定用葡萄糖氧化酶法。胰岛素用放射免疫法测定。生化指标在日立7170全自动生化分析仪上进行，糖化血红蛋白用高压液相法测定。

　　1.2.2 目标基因PCR扩增及测序 常规酚/氯仿

　　法提取研究对象周围血白细胞DNA，测定260 nm和280 nm的光密度值，计算DNA浓度。根据Primer引物设计程序设计与模板互补的引物（引物序列见表2），聚合酶链反应(PCR)扩增HNF1α基因启动子区及10个外显子区，以100 ng DNA为模板，在总体积50 μl内进行PCR，变性温度94℃，退火温度51℃～66℃，延伸72℃，反应后琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。PCR扩增产物纯化后由上海生工生物工程技术公司纯化后直接进行序列测定。测定结果与正常序列进行对比，查找有无基因突变位点及多态性。表2 HNF1α基因启动子及10个外显子区引物序列（略）
　　
　　1.3 统计学处理

　　采用统计软件SPSS11.0。基因型和等位基因频率采用直接基因计数法，各组间基因型和等位基因频率比较用χ2检验。