吡咯并喹啉醌对急性放射性皮肤损伤大鼠机体自由基的清除作用

　　　　作者：吴祁生 王建浩 周迎会 秦芳 沈力 吴士良

【摘要】 目的： 探讨高能电子射线照射大鼠急性皮肤损伤后，吡咯并喹啉醌（pyrroloquinoline quinone ，PQQ）对放射损伤后皮肤和血清中自由基的清除作用。方法： 采用电子直线加速器照射制作动物模型，以PQQ口服和辐照区喷射的给药方式，观察皮肤、血清中NOS，MDA和SOD含量的改变。结果： 与辐照未给药组大鼠相比，应用PQQ的大鼠皮肤、血清中的MDA和NOS显著下降(P&<0.05)，但高于正常组大鼠(P&<0.05)；皮肤中SOD含量明显升高(P&<0.05)，但低于正常组大鼠(P&<0.05)，血清中SOD变化不明显。结论： PQQ能有效提高自由基清除酶系活性，部分清除电子直线加速器照射后产生的自由基，但达不到正常水平。

【关键词】 吡咯并喹啉醌； 电子直线加速器照射； 放射损伤； 自由基

　　［Abstract］ Objective: To investigate PQQ scavenging free radicals in skin and serum of SD rats after linear accelerator radiation acute skin injury. Methods： The animal model of linear accelerator radiation injury was established， by PQQ oral administrations and jetting administrations， the contents of MDA，NOS，SOD in skin and serum were measured. Results： After PQQ administrations， to PQQ nottreating group， the contents of MDA and NOS decreased， were higher than the normal group(P&<0.05); while the contents of SOD in skin increased， were lower than the normal group(P&<0.05)， the changes of SOD in serum had no significance. Conclusion： PQQ can effectively improve the activities of the free radical scavenging enzymes， partly decrease free radicals produced by linear accelerator radiation， but can not reach the normal level.

　　［Key words］ pyrroloquinoline quinone； linear accelerator； radiation injury； free radical

　　放射性皮肤烧伤常见于肿瘤患者直线加速器放疗后发生的皮肤损伤、核燃料生产或辐射研究中由于核事故及防护疏忽导致皮肤遭到大剂量照射时产生的损伤，少数情况可由放射源丢失或仪器操作失误造成。机体会对放射线产生应激反应，氧自由基的产生及数量有很大的变化。我们曾经进行γ，β射线皮肤烧伤的研究，发现放射性皮肤烧伤后局部和全身自由基发生了一定的变化，尤其全身性效应［1］。吡咯并喹啉醌（pyrroloquinoline quinone ，PQQ）是一种新型的B族维生素，清除体内自由基，清除超氧阴离子和羟自由基的能力较抗坏血酸高50～100倍［2］。本研究采用直线加速器照射制作动物模型，观察应用PQQ后大鼠体内自由基变化情况，以进一步探讨氧自由基在放射损伤中的作用。

1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　吡咯并喹啉醌为复旦大学生物化学教研室惠赠；丙二醛(MDA) 、一氧化氮合酶(NOS) 、超氧化物歧化酶(SOD) 测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。

　　1.2 实验动物

　　SD近交系大鼠由苏州大学实验动物中心提供，正常3个月龄SD 近交系大鼠，体质量（150±20）g。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 高能电子射线照射SD大鼠急性皮肤损伤模型的建立与实验动物分组 使用Philips SL18型直线加速器进行4 Mev高能电子射线照射，剂量为45 Gy，照射部位为鼠臀部，非照射部位以铅板屏蔽，照射面积2 cm×2 cm，剂量率200 cGy／min，照射后分笼饲养。实验动物40只，随机分为4组：正常组；辐照未给药组（只给灭菌双蒸水）；PQQ喷射治疗组（300 mmol/L，灭菌双蒸水配制，2次/日）；PQQ口服治疗组（2 mg/kg体质量，1次/日）。每组10只。照射后各饲养10周，股动脉放血处死，分别取血、照射处局部皮肤。

　　1.3.2 血清及组织匀浆的制备 取出的血液置4 ℃， 1 h 后冷冻离心， 3 000 r/min ，5 min ，分离血清，置-20℃，进行各项指标测定。剪下的皮肤去毛、脱脂，用冰冻生理盐水略洗，滤纸吸干，称重后剪碎，加入1 ml 预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.2) ，4℃过夜，次日再加1 ml 冷磷酸盐缓冲液 ，用高速分散器制成匀浆。皮肤匀浆用冷冻离心机3 500 r/min 离心10 min ，上清液贮于-20℃，进行各项指标测定。

　　1.3.3 测定方法 (1)NOS的测定：NOS 催化LArg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm 波长下测定D，根据D值的大小计算出NOS 的活力。(2)MDA的测定：过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在520 nm 处有最大吸收峰。根据D值的大小可测定MDA含量。(3)SOD活性的测定：根据样品中SOD 能抑制反应体系中产生的超氧阴离子自由基氧化羟胺生成亚硝酸盐的原理，同时比色测定样品管和对照管中亚硝酸盐的量，按公式求出被测样品的SOD 活性。所有步骤均按测定试剂盒说明书操作。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS统计软件进行单因素ANOVA 检验。

2 结 果

　　电子直线加速器照射后，各组动物的血清、皮肤组织中NOS和MDA水平均显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。PQQ口服治疗组和喷射治疗组显著低于辐照未给药组(P&<0.05)，且PQQ喷射治疗组明显低于口服治疗组(P&<0.05)。电子直线加速器照射后，各组动物的皮肤SOD水平均有显著下降，与正常组比较，差异有统计学意义(P&<0.05)；辐照未给药组血清SOD水平比正常组明显降低(P&<0.05)，但PQQ口服治疗组和PQQ喷射治疗组的血清SOD水平与正常组比较差异无统计学意义。PQQ口服治疗组和喷射治疗组显著高于辐照未给药组(P&<0.05)；PQQ喷射治疗组高于口服治疗组(P&<0.05)。见表1。表1 高能电子射线对大鼠皮肤和血清中NOS，MDA和SOD的影响

3 讨 论

　　MDA是脂质过氧化的产物，NOS合成和释放NO，NO是自由基，MDA，NOS和NO三者的变化可以代表体内自由基水平的变化。SOD能催化超氧阴离子与羟自由基歧化为O2与h3O2，该酶为自由基的清除剂，其变化与体内自由基的变化呈负相关［3］。

　　PQQ是一种水溶性B族维生素，有清除体内自由基，保护机体的作用。PQQ能刺激合成辅酶Q，增强机体对过氧化氢、黄曲霉素、亚硝基化合物的抗毒和解毒作用，提高机体免疫力; PQQ具有很强的自由基清除能力，与NADPH反应形成PQQH，其清除超氧阴离子和羟自由基的能力较维生素C高50～100倍［4］。 本实验采用口服和局部喷射PQQ，发现在各组受照射鼠的皮肤、血清中，脂质过氧化物MDA和自由基NO合成酶NOS都有不同程度的增高，但是PQQ喷射治疗组低于PQQ口服治疗组，两者低于未治疗组；自由基清除剂SOD的变化基本与此相符合，各组皮肤中SOD都发生不同程度的下降，PQQ喷射治疗组高于PQQ口服治疗组，两者高于未治疗组，血清中变化不明显。Misra等［5］研究表明，在转脱氢酶基因的大肠埃希菌，PQQ的抗辐射/氧化应激防护能力是其清除活性氧物种本身和诱导其他自由基清除机制激活的原因，PQQ作为活性氧清除剂，通过直接的中和反应维持细菌胞内氧化压力而起到保护作用。本实验结果在动物体上验证了这一说法。PQQ既能有效提高自由基清除酶系活性，也能部分清除电子直线加速器照射后产生的自由基，但不能使之达到正常水平。

参考文献

［1］ 仇 灏， 周迎会，徐 岚，等. SD近交系大鼠经电子直线加速器照射后局部与全身自由基的变化［J］. 中国血液流变学杂志， 2001， 11(2): 97-99.

［2］ Kasahara T，Kato T. Nutritional biochemistry: A new redoxcofactor vitamin for mammals［J］. Nature， 2003， 422(6934): 832.

［3］ Chae HJ， Chae SW， Kang JS， et al. Effect of ionizing radiation on the differentiation of Ros 17/2.8 osteoblasts through free radicals［J］. J Radiat Res(Tokyo)， 1999， 40(4): 323-335.

［4］ He K，Nukada H，Urakami T，et al.Antioxidant and prooxidant properties of pyrroloquinoline quinone(PQQ): implications for its function in biological systems［J］. Biochem Pharmacol， 2003， 65(1): 67-74.

［5］ Misra HS，Kjairnar NP，Barik A， et al. Pyrroloquinolinequinone:a reactive oxygen species scavenger in bacteria［J］. FEBS Lett， 2004，578(1/2): 26-30