银杏叶提取物对糖尿病大鼠肾组织 MMP2及TIMP2表达的影响

　　　　　　作者：毛春谱， 李小毅， 林桂芬

【摘要】 目的： 观察基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶抑制因子2（TIMP2）在糖尿病大鼠肾组织中的表达及银杏叶提取物（EGB）对两者表达的影响。方法： 30只雄性SD大鼠随机分为3组：正常对照组（C组），糖尿病组（DM组），EGB治疗组（EGB组，8 mg·kg-1·d-1）。腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠造成糖尿病模型，EGB组用银杏叶提取物进行灌胃。8周后，用免疫组化方法检测各组大鼠肾皮质MMP2、TIMP2的蛋白表达。结果： 糖尿病组大鼠肾小球MMP2蛋白表达较正常对照组明显减少，TIMP2蛋白明显升高（P&<0.01）；EGB组MMP2较糖尿病组表达升高（P&<0.01）、TIMP2表达较糖尿病组减少（P&<0.01）。结论： EGB可通过调节MMP2/TIMP2的平衡，减少细胞外基质积聚而对糖尿病大鼠起到肾脏保护作用。

【关键词】 银杏叶提取物；糖尿病肾病；基质金属蛋白酶2；基质金属蛋白酶抑制因子2

　　［Abstract］ Objective: To investigate the protective effect and possible mechanisms of extract of Gingko biloba on diabetic nephropathy(DN) in streptozotocininduced rats.Methods： Thirty SpragueDamly rats were randomly pided into three groups：normal control group（C group），diabetes mellitus group（DM group）and diabetic group treated with extract of Gingko biloba（8 mg·kg-1·d-1）（EGB group）.Diabetic model was induce by streptozotocin（60 mg·kg-1）and remedial perfusing stomach by administrating EGB was done on the EGB group.8 weeks later，the expression of MMP2 and TIMP2 in kidney tissue was determined by immunohistochemistry methods. Results： Compared with C group，the expressions of protein MMP2 significantly reduced in glomeruli，while expressions of TIMP2 was increased in the DM group（P&<0.01）.The abnormal expressions of these proteins were dramatically improved in diabetic rats by EGB treatment（P&<0.01）. Conclusion： EGB has some renal protective effect on diabetic rats，through inhibition of excessive deposition of glomeruli extracellular matrix by regulating the balance of MMP2 and TIMP2.

　　［Key words］ extract of Gingko biloba；diabetic nephropathy；matrix metalloproteinase2； tissue inhibitor of metalloproteinase2

　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最重要的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病患者主要的死亡原因之一。银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)药理活性广泛［1］，具有改善微循环、抗氧化等特点，因此对肾脏有保护作用，但肾保护是否通过基质降解途径的机制尚不清楚。本实验以链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型，从生化指标、形态学变化、免疫组化基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2，MMP2）和基质金属蛋白酶抑制因子2（tissue inhibitor of metalloproteinase2，TIMP2）等方面，探讨EGB对DN的保护机制。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　清洁级雄性SD大鼠30只， 2月龄，体质量180～220 g（徐州医学院实验动物中心），链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司），银杏叶提取物（江苏扬子江药业有限公司）。一抗分别为兔抗大鼠 MMP2，TIMP2（武汉博士德生物工程有限公司）抗体，二抗SP6001试剂盒及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），LEICA Qwin图像处理与分析系统（德国）， 罗氏血糖仪（上海罗氏公司）， 日立7600型全自动生化分析仪（日本日立公司）。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 糖尿病模型的建立和实验分组 将30只SD大鼠随机分为：正常对照组（C组，n=10）、糖尿病组（DM组，n=10）和银杏叶提取物治疗组（EGB组，n=10），均分笼饲养。在禁食12 h后，DM组和EGB组于左下腹腔一次性注射STZ（溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4）60 mg/kg，72 h后，尾静脉采血测随机血糖≥16.7 mmol/L，血糖稳定1周后作为模型纳入本实验。C组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。20只大鼠经检测均造模成功，模型成立3 d后治疗组给予EGB（8 mg·kg-1·d-1）进行灌胃，C组和DM组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠试验期间自由饮水进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。

　　1.2.2 标本收集 连续观察 8周后收集标本。代谢笼中收集24 h尿，离心保存于-20℃的冰箱待测尿微量白蛋白（MAU）。称量体质量后，用10％水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖（BG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）。用4℃冰冷生理盐水灌洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾质量（kindey weight，KW）和体质量（body weight，BW）的比值作为肾脏指数（kidney/body weight ratio，KI）的指标。左肾部分置于10％中性甲醛中固定，以备光镜、免疫组织化学研究。分离肾皮质和髓质，右肾取皮质１ mm×1 mm×1 mm标本放入3％戊二醛中固定，留作电镜研究。

　　1.2.3 生化指标的测定 BG采用葡萄糖氧化酶法检测，HbA1c采用亲和层析法检测，MAU采用胶体金双抗体夹心法检测，BUN，Scr，TC，TG由日立7600型全自动生化分析仪检测。

　　1.2.4 常规光镜检测 肾组织经10％甲醛固定，常规脱水、包埋，切片厚4 μm，行HE染色和免疫组化。

　　1.2.5 透射电镜检测 肾皮质经固定，脱水，浸透，包埋，制备半薄及超薄切片，电镜观察。

　　1.2.6 免疫组化研究 采用SP两步法，石蜡切片厚4 μm后常规脱蜡至水，3％h3O2阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原， 滴加MMP2，TIMP2一抗（1∶50），4℃冰箱过夜，PBS洗片后滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB显色控制在3～5 min，复染、脱水、透明、封片。以灰度值（A）表示显色强度，用LEICA Qwin图像处理与分析系统进行分析，每组取6张切片、每张切片随机取8个视野的肾小球进行半定量分析。

　　1.3 统计学处理

　　计量资料用均数±标准差（±s）表示， 应用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

　　2.1 3组大鼠一般情况和常规生化指标

　　DM组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体质量减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等症状十分明显。BG，KI，MAU，Scr，BUN，HbA1c，TC，TG的数值变化见表1。DM组和EGB组BG，HbA1c，KI，MAU较C组明显升高(P&<0.01)，BUN，Scr各组差异无统计学意义（P&>0.05），EGB组较DM组KI降低， TG，TC，MAU指标明显改善（P&<0.01），但BG，HbA1c差异无统计学意义（P&>0.05）。

　　2.2 一般形态学改变

　　与C组比较，光镜下DM组大鼠显示肾小球内细胞数显著增多，毛细血管管腔狭窄甚至闭塞，EGB组较DM组上述病理改变得到改善。见图1。

　　2.3 肾脏超微结构改变

　　透射电镜下显示C组肾小球毛细血管基底膜呈线性状，厚度均匀、规则，足状突起排列有序，无足突融合，系膜基质不增多；DM组基底膜显著增厚、不规则，并且可见上皮细胞的足突融合，系膜基质显著增多，上述病理改变在EGB组得到改善。见图2。

　　2.4 免疫组化结果

　　结果显示阳性颗粒主要定位于肾小球和肾小管：DM组与C相比MMP2降低、TIMP2升高(P&<0.01)；EGB组与DM组相比MMP2升高、TIMP2降低(P&<0.01)。灰度值（A）见表2及图3。表1 三组大鼠常规生化指标比较

　　正常对照组(C组)糖尿病组(DM组)银杏叶提取物治疗组（EGB组）图2 肾小球超微结构变化（透射电镜，×8 000)表2 银杏叶提取物对糖尿病大鼠MMP2，TIMP2 表达的影响

3 讨 论

　　DN的主要病理特征是基底膜增厚和系膜区细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）堆积，最后发展成肾小球硬化。ECM主要由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等组成，其积聚和降解的平衡失调是导致肾小球硬化的关键病理过程之一［2］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在降解ECM中起着主要的作用，能降解除多糖以外的所有ECM的成分。按作用底物可将MMPs分为五类：胶原酶、明胶酶、基质溶解酶、膜型MMPs和其他类。MMP2属于白明胶酶，在肾小球系膜细胞、内皮细胞、成纤维细胞等均有表达，主要降解Ⅳ型胶原。其活性受TIMP2影响［3］，MMP2/TIMP2之间的平衡在调节ECM的降解中起着重要的作用。

　　本实验免疫组化研究结果显示，DM组较C组肾小球MMP2表达减少、TIMP2表达明显增加。经EGB治疗后MMP2的阳性面积增加、颜色增浓，TIMP2的表达则相反。同时病理形态学上也得到改善，这与既往研究结果一致［4，5］。

　　脂质代谢紊乱对肾小球系膜细胞、上皮细胞和内皮细胞均具有细胞毒作用，可使细胞变性、坏死，加重了DN的发生与发展［6］。EGB组TC、TG改善可能也与肾保护有关，与DM组比较，EGB组的HbA1c无差异，表明其肾保护不是血糖降低所致。

　　综上所述，EGB可能通过上调MMP2和下调TIMP2的表达来调节ECM的降解和合成达到对肾脏的保护作用，这种保护作用是独立于血糖之外的；此外，EGB还具有降低血脂的作用，减轻脂毒性是其肾脏保护作用机制之一。

参考文献

［1］ 毛孙忠，陈国荣，雷康福，等.银杏叶提取物对糖尿病大鼠睾丸损伤的作用［J］.中国病理生理杂志，2004，20(7): 1238-1242.

［2］ Lenz O，Elliot SJ，StetlerStevenson WG.Matrix metalloproteinases in renal development and disease［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11(3):574-581.

［3］ Sec DW，Li H，Guedez L，et al.TIMP2 mediated inhibition of angiogenesis：an MMPindependent mechanism［J］. Cell，2003，114（2）：171-180.

［4］ Han SY，Jee YH，Han KH，et al.An imbalance between matrix metalloproteinase2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase2 contributes to the development of early diabetic nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21(9):2406-2416.

［5］ Song Y，Li C，Cai L，et al.Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factormediated extracellular matrix accumulation［J］.Exp Mol Pathol，2004，76(1):66-75.

［6］ Steinberg D.Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance［J］.J Biol Chem，1997，272(34):20963-20966.