亚硒酸钠对人结肠癌细胞的抑制机制

　　　　 作者：韩晓红，邵世和，许化溪，薛延军，刘嫣芳，邓一脉，陈卫伟，曹娟

【摘要】 　　目的：研究亚硒酸钠对人结肠癌细胞的抑制机制。方法： 通过DNA末端原位标记染色法（ TUNEL）检测亚硒酸钠溶液对人结肠癌细胞株SW111C凋亡的影响；应用免疫组织化学染色技术观察亚硒酸钠对人结肠癌细胞株SW111C p16，p21，PCNA，CD44基因表达的影响；并测定亚硒酸钠对小鼠T淋巴细胞亚群的影响。结果： TUNEL染色法表明亚硒酸钠作用细胞后凋亡指数明显升高(P&<0.01)，且具有剂量-效应关系；亚硒酸钠作用后人结肠癌细胞SW111C p16和p21基因的蛋白表达上调，PCNA和CD44基因的蛋白表达下调；亚硒酸钠能使小鼠CD3+，CD4+细胞数增加，而且CD4+/CD8+比值升高，与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.05）。结论： 亚硒酸钠可通过诱导细胞凋亡，影响p16，p21，PCNA，CD44基因表达和提高机体的免疫功能而抑制SW111C 的生长。

【关键词】 亚硒酸钠；SW111C细胞；凋亡；p16；p21；PCNA；CD44；T淋巴细胞亚群

　　［Abstract］Objective: To investigate the inhibition mechanism of sodium selenite on SW111C cells. Methods： The apoptosis of SW111C cells treated with sodium selenite was observed by TUNEL.The expression of p16，p21，PCNA，CD44 treated with sodium selenite was performed by immunohistochemistry technique. The Tlymphocyte subsets were detected by animal experiment. Results： The apoptotic index of SW111C cells increased and was positively correlated to the concentration of sodium selenite(P&<0.01).The expression of p16 and p21 was upregulated and the expression of PCNA and CD44 was down regulated after treated by sodium selenite.After exposure to sodium selenite，the number of CD3+ and CD4+ cells in mice increased and CD4+/CD8+ increased too（ P&<0.05）. Conclusion： The sodium selenite could inhibit the proliferation of SW111C cells by inducing cell apoptosis， and influence the expression of p16，p21，PCNA，CD44 with improving immune function.

　　［Key words］sodium selenite; SW111C cells; apoptosis; p16; p21; PCNA; CD44; Tlymphocyte subsets

　　大量流行病学调查、动物实验及临床实验研究结果表明微量元素硒与结肠癌的发生率和死亡率呈负相关，外源性补硒能有效抑制多种人类肿瘤的发生与发展［1］。本实验以人结肠癌细胞株SW111C为研究对象，应用DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测亚硒酸钠溶液对人结肠癌细胞株SW111C凋亡的影响，应用免疫组织化学染色技术观察亚硒酸钠对人结肠癌细胞株SW111C p16，p21，PCNA，CD44基因表达的影响，并测定亚硒酸钠对小鼠T淋巴细胞亚群的影响，旨在探讨亚硒酸钠在结肠肿瘤预防和治疗过程中潜在的应用价值，为深入研究硒与肿瘤的关系提供资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及动物

　　SW111C细胞株购自吉林省肿瘤研究所；小鼠（BALB/c，雄性，18～20 g）购自吉林省生物制品所；亚硒酸钠（Na2SeO3·5h3O）为沈阳市试剂五厂生产；1640培养液购自Life，Technogies公司；胎牛血清、胰蛋白酶购自北京鼎国生物技术发展中心；细胞凋亡原位检测试剂盒购自深圳晶美公司；鼠抗人p16，p21，PCNA，CD44单克隆抗体，免疫组化SAP即用型试剂盒，磷酸酶底物BCIP/NBT显色浓缩液，多聚赖氨酸，ClerMount封片剂均购自北京中山生物技术有限公司；小鼠T细胞亚群检测试剂盒购自北京邦定医学生物公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 DNA末端原位标记染色法［2］检测细胞凋亡

　　取对数生长期结肠癌细胞5×104/ml培养24 h，加入终浓度为20， 10和5 μmol/L的亚硒酸钠，对照组不加亚硒酸钠（每组3瓶）。细胞培养24 h终止培养，收集细胞并涂片，4%低聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min，预冷0.1%TritonX100处理，4℃ 2 min，PBS洗涤。以下步骤按试剂盒说明进行。凋亡指数（apoptosis index，AI）计算方法：数5个高倍镜&>1 000 个细胞，分别计数凋亡细胞和总细胞数，AI =凋亡细胞数/总细胞数 × 100 %。

　　1.2.2 免疫组化法测定p16，p21，PCNA，CD44基因表达

　　p16，p21，PCNA，CD44基因检测采用链霉素卵白素-生物素（SAP）免疫组化技术，操作按说明书进行，PBS代替第一抗体作阴性对照。

　　1.2.3 亚硒酸钠溶液对小鼠T淋巴细胞亚群的影响

　　小鼠称重并随机分组，分为亚硒酸钠低、中、高3个实验组（每克重小鼠每日分别灌胃1.0，1.5，2.0 μg亚硒酸钠）及对照组（生理盐水灌胃），每组8只。饲养40天后断头取血涂片，用小鼠T细胞亚群检测试剂盒检测。细胞涂片标本室温干燥2 h以上，滴固定液1滴，固定1～2 min后PBS洗。加抗T淋巴细胞亚群单克隆抗体15 μl，放湿盒37℃ 30 min，加羊抗鼠IgG二抗15 μl，37℃ 30 min，加APAAP复合物15 μl， 37℃ 30 min，加碱性磷酸酶底物显色液25 μl，37℃ 30 min，用自来水冲洗终止显色，加苏木素复染液1滴作用1 min，自来水冲洗，光学显微镜观察并计数。

　　1.3 统计学处理

　　各组实验数据用±s表示，采用SPSS15.0软件进行单因素方差分析，组间比较用q检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 亚硒酸钠诱导后SW111C细胞凋亡指数

　　TUNEL检测结果显示亚硒酸钠终浓度在10 μmol/L以上时可诱导SW111C细胞凋亡，其作用具有剂量-效应关系。5 μmol/L组（7.0±1.1） %与对照组（7.6±0.9） %相比，P&>0.05；20 μmol/L组（27.0±2.9）%，10 μmol/L组（16.0±2.3）%与对照组相比，P&<0.01，且20 μmol/L组高于10 μmol/L组（P&<0.01）。

　　2.2 亚硒酸钠作用后SW111C细胞p16，p21，CD44，PCNA基因表达

　　2.2.1 p16，p21基因表达

　　亚硒酸钠作用于SW111C细胞24 h后，与空白对照组相比p16，p21基因表达增强，表现为阳性细胞数增多及染色强度增强，见图1，图2。

　　2.2.2 CD44，PCNA基因表达

　　亚硒酸钠作用于SW111C细胞24 h后，与空白对照组相比CD44，PCNA基因表达降低，表现为阳性细胞数减少及染色强度减弱，见图3，图4。

　　2.3 亚硒酸钠溶液作用后小鼠T细胞亚群检测结果
　　
　　T细胞亚群检测结果显示亚硒酸钠溶液作用后小鼠CD3＋，CD4＋细胞数增加，而且CD4＋/CD8＋比值升高，与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.05），结果见表1。表1 不同浓度亚硒酸钠作用后小鼠T淋巴细胞亚群检测结果（略）

　　3 讨论

　　硒是人体必需的微量元素，具有抗肿瘤作用，并可影响癌基因与抑癌基因的表达，与恶性肿瘤间存在明显的负相关关系［3］，肠癌的发生与癌基因和抑癌基因异常表达有一定的相关性。p16基因是人们发现的第一个直接作用于细胞周期抑制细胞分裂的抑癌基因，阻止细胞由G1期进入S期，从而使细胞增殖停止。p16基因的任何缺失和突变都可使细胞异常增殖而发生肿瘤。陈萍等［4］的研究表明p16基因缺失可能是非小细胞肺癌发生的早期始动环节，检测相关标本中p16基因缺失对肺癌的早期诊断有重要意义。p21/WAF1是野生型p53的激活片段（WAF1），是重要的细胞周期抑制蛋白，通过阻止细胞周期进程和促进细胞分化负责对细胞周期进行调控，当DNA损伤时，p53上升通过β转录生长因子方式诱导p21/WAF1产生，导致细胞G1期阻滞和凋亡［5］。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶辅助因子，细胞增殖信号必须通过PCNA参与才能引发DNA合成。PCNA在许多肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤的恶性程度呈正相关，是细胞活跃分裂的指标［6］。CD44为细胞表面黏附分子，又称P糖蛋白，在多种细胞表面表达，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，其表达程度直接影响癌细胞的脱离和再附着，参与肿瘤细胞的增生和转移。肿瘤的转移每个环节均有CD44高表达，有助于肿瘤细胞的黏附和转移［7］。本研究结果表明：亚硒酸钠可使p21及p16基因表达增强、PCNA及CD44基因表达降低。PCNA基因减少，细胞DNA合成减少，进一步使肿瘤细胞增殖受阻或减慢。

　　文献报道亚硒酸钠可诱导胃癌SGC7901细胞凋亡［8］。本实验结果表明亚硒酸钠可诱导SW111C细胞凋亡，且该作用与亚硒酸钠浓度有关，表现为较小剂量（亚硒酸钠终浓度在5 μmol/L以下）时无此作用，较大剂量（亚硒酸钠终浓度在10 μmol/L以上）时可诱导细胞凋亡，具有剂量-效应关系。

　　T淋巴细胞是构成机体抗肿瘤免疫防御系统的重要因素，包括CD3＋， CD4＋，CD8＋细胞亚群。多种恶性肿瘤患者伴有T淋巴细胞亚群异常和CD4＋/CD8＋比值失调［9］。本实验结果显示补硒组小鼠CD3＋，CD4＋细胞数升高，且CD4＋/CD8＋比值上升。小鼠T亚群细胞数及比例改变必引起免疫功能改变，CD3＋，CD4＋和CD8＋淋巴细胞是具有免疫活性的细胞，这些细胞的活性上升，可以导致机体对外来抗原的识别和清除功能上升，表明亚硒酸钠可以通过激发机体免疫系统而在抑制肿瘤生长过程中发挥作用。

参考文献

　　［1］Redman C， Scott JA， Baines AT，et al. Inhibitory effect of selenomethionine on the growth of three selected human tumor cell lines［J］.Cancer Lett，1998，125（2）:103-110.

　　［2］谭继宏，涂水平，蒋晓华，等.氧化砷诱导胃癌细胞凋亡的实验研究［J］.中华消化杂志，2000，20（1）：37-39.

　　［3］俸家富，李少林.硒、硒蛋白和硒的抗癌机理［J］.微量元素与健康研究，2001，18（1）：70-72.

　　［4］陈萍，李坚，殷凯生，等.非小细胞肺癌p16基因缺失的研究［J］.江苏大学学报:医学版，2004，14（2）：106-109.

　　［5］Kolar Z，Murray G，Scott K，et al. Relation of Bcl2 expression to androgen receptor，P21 WAF1/CIP， and cycliD1 status in prostate cancer［J］.Clin Pathol， 2000， 53(1):15-18.

　　［6］庄小强，林三仁，郑杰，等.胃黏膜病变与cmet原癌基因表达的关系及预后意义［J］.中华消化杂志，2001，21（2），116-118.

　　［7］孙宜，侍庆.卵巢癌中p53基因突变和粘附分子CD44V6的表达［J］.中国癌症杂志，2001，1（1）：19-20.

　　［8］刘木清，邵世和，段秀杰.亚硒酸钠对胃上皮癌细胞增殖和凋亡的影响［J］. 中国免疫学杂志，2006， 22（2）：145-147.

　　［9］Hernberg W， Muhonen T， Turunen JP， et al. The CD4/CD8 ratio as a prognostic factor in patients with metastasis melanoma receiving chemoimmunotherapy［J］. J Clin Oncol， 1996， 14(5):1690-1696.