作者：刘超，王云，顾继伟，袁亚伟，冯东，高致炳
【摘要】 目的 探讨缝隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）在缺血预处理心肌保护中的作用和地位。方法 将48只SD大鼠分为假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理组（IP组）和5-羟基癸酸+缺血预处理组（5-HD + IP组），测定各组的心律失常评分和心肌梗死面积，采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测各组心肌Cx43的表达水平。结果 IR组和5-HD+IP组的心律失常发生多于IP组，评分明显高于IP组（P＜0.01）；IR组和5-HD+IP组的IS/AAR比值明显大于IP组（P＜0.01）；与IR组和5-HD+IP组比较，IP组Cx43 mRNA的表达明显增强（P＜0.01）。IP可以减少心律失常发生，减小心肌梗死面积，增强Cx43的表达，5-羟基癸酸可以阻断IP的心肌保护作用。结论 IP通过开放线粒体ATP敏感性钾通道保持Cx43磷酸化，进而实现心肌保护。
【关键词】 缝隙连接蛋白43；缺血再灌注损伤；缺血预处理；心肌保护
Abstract: Objective To investigate the effect and status of connexin 43 on myocardial protection in ischemic preconditioning.Methods 48 Sprague-Dawley rats were randomly pided into four groups: S，IR，IP，5-HD+IP.The myocardial infarct size and arrhythmia score were measured.The expression of connexin 43 was detected by RT-PCR.Results Compared with group IP，arrhythmia score and IS/AAR was higher and the expression of connexin 43 was notablely lower in group IR and group 5-HD+IP (P＜0.01).Ischemic preconditioning might reduced arrhythmogenesis and myocardial infarct size，meanwhile enhanced the expression of connexin 43.5-hydroxydecanoate acid might interdicted the myocardial protection of IP (P＜0.01).Conclusion Ischemic preconditioning might play an important role in myocardial protection by activating mitochondrial ATP sensitive potassium channel and preserving connexin 43 posphorylation.
Key words:connexin 43；ischemia-reperfusion injury；ischemic preconditioning；myocardial protection
如何减轻再灌注损伤、保护缺血心肌，一直是心血管病学领域研究的重要内容，缺血预处理（Ischemic preconditioning，IP）被认为是一种最有效的心肌保护方法，缺血预处理能使心室细胞间最主要的缝隙连接蛋白43（Cx43）表达量增加，分布模式改变以实现心肌保护，Cx43在心肌IP中的作用越来越受到重视，本研究旨在探讨Cx43在缺血预处理心肌保护中的作用和地位。
1 材料与方法
1.1 对象和材料
健康雄性SD大鼠48只（宁夏医科大学实验动物中心提供），体重250～300g。伊文氏蓝（Even’s Blue，AMERSCO公司），氯化三苯基四氮唑（TTC，AMERSCO公司），5-羟基癸酸（5-hydroxydecanoate acid，5-HD，Sigma公司），SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司），Accesss RT-PCR系统A1250（Promega公司），TRIzol Reagent（Invitrogen公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型构建及实验分组
大鼠随机分为4组，每组12只。称重后腹腔注射3%戊巴比妥钠60mg·kg-1。麻醉后固定于实验台，气管插管连接ALC-V8型动物呼吸机，呼吸频率70次·min-1，潮气量6～7mL·次-1。持续记录心电图，信号输入BL-420F生物机能实验系统保存。在胸骨左缘第3、4肋间开胸，于左心耳下缘与肺动脉圆锥间前降支处留置结扎线。（1）假手术组（S组）：建立动物模型后仅穿线而不结扎；（2）缺血再灌注组（IR组）：结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min；（3）缺血预处理组（IP组）：结扎左冠状动脉前降支5 min，再灌注5 min，重复3次后同IR组；（4）5-羟基癸酸和缺血预处理组（5-HD +IP组）：于IP前15 min按5mg·kg-1 iv.后同IP组。
1.2.2 心律失常的测定
记录各组室性期前收缩次数（VE）、室性心动过速时间（VTt）、心室颤动时间（VFt）和其他心律失常的发生情况，用心律失常评分量化心律失常的严重程度，根据Lambeth规则进行心律失常分析，参考Wang等［1］的评分标准：（1）0分：无室性心律失常；（2）1分：偶发室性期前收缩（l min内发生3次以下的VE）；（3）2分：频发室性期前收缩（l min内发生3次或3次以上的VE）；（4）3分：偶发性室性心动过速（l min内发生3次以下的VT）；（5）4分：频发性室性心动过速（l min内发生3次或3次以上的VT）或偶发性室颤（l min内发生3次以下的VF）；（6）5分：频发性室颤（l min内发生3次或3次以上的VF）或死亡。
1.2.3 心肌梗死面积的计算
每组随机选取6只大鼠，用Even’s Blue-TTC法测定心肌梗死面积。心肌缺血再灌注末再次结扎前降支，5% Even’s Blue 1mL注入左心耳，以区分心肌的梗死区（不染色）和非心梗区，取出心脏后切成5～6片约2mm厚的心肌片，置2mL 1% TTC磷酸缓冲溶液中（pH 7.4），在37℃温孵20 min染色后，置10%的甲醛中固定，缺血危险区（AAR）为红色，梗死区（IS）为白色。每张心肌切片数码照相，采用Image-Pro Plus 5.0 图象分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）以求积法测定缺血区和梗死区面积，心肌梗死的严重程度以IS/AAR表示，IS/AAR=∑（梗死面积×切片重量）/∑（缺血面积×切片重量）×100%。
1.2.4 RT-PCR
取余24只大鼠左室心肌组织50～100mg，采用TRIzol 试剂提取样本总RNA，再用Accesss RT-PCR系统A1250合成Cx43和β-actin的cDNA。引物序列：Cx43上游引物：5’-TGT AAC ACT CAA CAA CCT GGC-3’，下游引物：5’-GGT TTT CTC CGT GGG ACG TGA-3’，产物462bp；β-actin上游引物：5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’，下游引物：5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3’，产物764bp。扩增条件：48℃45min，94℃ 2min；变性94℃ 30s，退火53℃ 1min，延伸68℃ 2min，共40个循环；最终延伸68℃ 7min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察并拍摄电泳图像，Quantity one v4.6.2（BIO-RAD）图像分析软件进行荧光半定量分析，测定平均光密度值（OD），用Cx43与β-actin的Density值表示Cx43 mRNA的表达水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，结果分析采用t检验和单因素方差分析。
2 结果
2.1 心律失常情况
除S组偶见VE，其他三组再灌注30 min内多表现出VE和VT，IR组和5-HD+IP组的心律失常发生多于IP组，评分明显高于IP组，差异均有统计学意义（P＜0.01，见表1）。表1 各组大鼠心律失常发生情况(略)
2.2 心肌梗死面积测定
S组未见心肌梗死区，IR组和5-HD+IP组的IS/AAR比值明显大于IP组，差异有统计学意义（P＜0.01，见表2）。表2 各组大鼠心肌梗死面积的比较(略)
2.3 Cx43 mRNA的表达
与S组比较，IR组和5-HD+IP组Cx43 cDNA产量低，电泳条带表达弱，差异有统计学意义（P＜0.01），与IR组比较，IP组Cx43 mRNA的表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.01，见表3、图1）。表3 各组大鼠心肌Cx43的半定量分析结果(略)
3 讨论
20世纪80年代，Murry等［2］首次提出心肌缺血预处理的概念，经过几次短暂重复的缺血/再灌注，能够提高心肌对以后较长时间缺血的耐受性。临床观察进一步表明，IP是目前已知最有效的心肌保护措施，除了能减少心肌梗死的面积，也能降低心律失常的发生率［3］。IP的心肌保护机制可能与腺苷、缓激肽、阿片受体等有关，线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATP）被认为是IP的最终作用环节，mitoKATP的激活使钾离子内流增加，线粒体内膜去极化，减轻细胞内钙离子过度负荷，最终减少ATP消耗；由于线粒体的短暂水肿，增加了呼吸链作用，ATP产生增加，使心肌耐缺血能力增加，同时抗凋亡作用也参与保护机制，从而实现IP的心肌保护作用。mitoKATP的激动剂可以对抗心肌缺血造成的损伤，而阻断剂可以阻断这种保护作用。5-HD是mitoKATP的阻断剂，据文献［4］报道，5-HD可以取消预处理延迟心肌细胞之间电脱耦联的作用，也可以取消预处理对心肌细胞膜上Cx43的磷酸化和向胞内转移的作用。本研究发现，IP组大鼠心律失常的发生情况明显减少，心肌梗死的范围也明显缩小，但给予mitoKATP阻断剂5-HD后再进行缺血预处理时，则没有出现相似的效应，提示5-HD可能通过抑制mitoKATP的开放阻断了IP的心肌保护作用。
Cx43是构成心室细胞间缝隙连接通道最主要的蛋白，它的正常表达与分布是间隙连接通道电偶联功能正常、心脏正常电活动和协调舒缩的重要保证［5］。基础状态下大部分心肌细胞的Cx43处在磷酸化状态，心肌缺血时Cx43的表达降低并快速脱磷酸化，缝隙连接发生重塑，表现在含量、分布及功能上的异常，导致心肌细胞间传导减慢和电传导耦联能力的下降，从而增加诱发心律失常的倾向。IP能维持整个心肌细胞膜和胞浆内Cx43的表达，在经历再灌注损伤时保持磷酸化Cx43的含量，减少Cx43脱磷酸化，从而保持Cx43构成的缝隙连接的基本结构，减少心律失常的发生［6］。Miura等［7］还在试验中发现IP可以通过激活PKC激酶维持磷酸化Cx43的水平，关闭缝隙连接通道，减少死亡因子的扩散来发挥缩小心肌梗死范围的作用。更有研究发现，给予缝隙连接通道解耦联剂heptanol后或缺失Cx43基因的杂合小鼠进行缺血再灌注时都不能诱导出IP的效应［8－9］。由此可见，Cx43在IP的心肌保护作用中极为重要。本研究发现IR组发生心律失常时间长，并可以导致心肌梗死的发生，同时Cx43的分布紊乱、表达减弱，提示Cx43也参与了缺血再灌注损伤。在IP组实现缺血预处理的心肌保护作用时，Cx43的分布趋于正常，表达较无预处理保护的大鼠明显增强，而使用5-HD后Cx43的表达减弱，提示IP能够维持Cx43的磷酸化水平，保持Cx43的正常分布和表达，而5-HD 消除了IP的这种作用，使Cx43的分布紊乱、表达减弱，这表示Cx43可能参与了mitoKATP诱导IP的心肌保护作用。近年来国内外研究也支持此观点，通过Western blot方法从大鼠、猪和人的左心室心肌细胞分离出的线粒体中均发现了Cx43的表达，且IP能够增加线粒体中Cx43的含量，对实验动物进行缺血预处理后，由于mitoKATP开放，可维持线粒体内ATP的生成，有利于Cx43的磷酸化［10－11］。
综上所述，国内外对缺血预处理的心肌保护作用较为肯定，本研究使用大鼠在体心脏模型发现Cx43参与了mitoKATP诱导IP的心肌保护作用，初步证实了Cx43在IP中的作用和地位，另外，mitoKATP阻断剂能够阻断IP的心肌保护作用，但Cx43潜在的保护作用机制以及线粒体中Cx43的重要作用目前还不明确，仍需进一步研究，尤其是促进Cx43电耦联的药物研究，在心肌缺血时减少心律失常、减小心梗面积、降低病死率方面具有重要的临床意义。
参考文献
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