作者：孙俊锋，棘怀庆，雄英，李宗吉，王娅娜，赵巍
【摘要】 目的 用生物信息学方法从世界权威数据库检索筛选能用于诊断或治疗的细粒棘球蚴靶蛋白。方法 基于其他相近物种的寄生虫及其靶蛋白研究，在美国生物技术信息中心（NCBI）连接的SwissProt，PIR，PRF，PDB等数据库进行有价值靶蛋白及其同源蛋白的筛选，最终筛选出在其他寄生虫目前用于靶蛋白研究的蛋白或多肽，通过讨论分析，找出能作为细粒棘球蚴诊断或药物疫苗靶位的蛋白质和多肽。结果 通过检索扁形动物门的蛋白，筛选出目前该门类下所有物种已经成熟应用或正在研究的有价值的候选蛋白：共得到154条包括32种蛋白。结论 通过高通量快速筛选法，找出32种可能用于包虫病诊断和防治的靶位蛋白，为今后蛋白质组学高通量筛选细粒棘球蚴靶标分子提供理论依据和参考。
【关键词】 细粒棘球蚴；生物信息学；靶标分子；扁形动物门；高通量筛选
Abstract: Objective To screen specific target proteins for early diagnosis or therapy of echinococcosis by screening the authoritative databases from all over the word with bioinformatics method.Methods Based on studies on target proteins of other similar species，we screened these valuable proteins or their homologous proteins from American National Center for Biotechnology Information which links with the database of proteins，such as SwissProt，PIR，PRF，PDB et al.After screening out these valuable proteins or peptides of Platyhelminthes，we found some of them for Echinococcus granulosus (Eg) through analysis and demonstrations.Results We got the valuable proteins or peptides applied already or been researching on diagnosis or therapy of species of Platyhelminthes，including 154 of them that could be classified as 32 kinds.Conclusion 32 kinds candidate of proteins (peptides) were screened for Eg. diagnosis and therapy which would provide the academic basis to further proteomic researches of screening target proteins of Eg.
Key words:Echinococcus granulosus;bioinformatics; target molecule;Platyhelminthes;high-throughput
包虫病是由细粒棘球绦虫的蚴虫寄生到人体或家畜体内而引发严重危害人畜健康的人兽共患寄生虫病。包虫病防治的理想阶段是在早期预防和药物治疗阶段［1］。随着基因组学和蛋白质组技术的发展，新药开发的研究，尤其新型药物作用靶蛋白筛选研究发展的极为迅速，本研究拟用生物信息学方法从世界权威数据库检索筛选能用于诊断或治疗的细粒棘球蚴靶蛋白。
1 材料与方法
利用美国生物技术信息中心（NCBI） Entrez检索系统，在蛋白质数据库检索扁形动物门目前已经上传注册的蛋白质或肽段，从得到的扁形动物门所有物种蛋白质研究的总体状况，用关键词进行快速检索分类，同时结合MEDLINE
参考文献
对蛋白质进行分类分析。对于信息不详，或者命名不规范的蛋白质，通过NCBI BLAST2.2.10分析软件［2］在蛋白库中进行同源序列比对［3］，e-value参考值设定为20。然后对蛋白进行保守区域分析，使用HMMPfam分析软件［4］对蛋白进行超家族归类分析，将同一超家族的蛋白归为一类，e-value值设定为1e-1［5］。使用关键词“Platyhelminthes”在NCBI Entrez中的protein条目下检索注册到NCBI数据库的蛋白或肽段。然后按物种进行分类，得出扁形动物门各物种的蛋白组学研究状况［6］。
基于以上研究状况，然后分别输入关键词“target”、“candidate”、“diagnosis”用逻辑符号AND连接“Platyhelminthes”在NCBI Entrez中的protein条目下检索目前用于靶位蛋白、候选分子和诊断蛋白的蛋白，分别获得进行研究或已经得到应用的物种、研究领域以及这些分子的研究方向。
筛选出的分子中部分蛋白仅仅有一代码或分子量，对这些分子的核酸序列用BLAST 2.2.10进行同源序列比对，同时用HMMPfam对这序列进行保守区超家族分析。最后将归类后的蛋白进行结果分析
2 结果
2.1 扁形动物门蛋白有32276条相关蛋白信息，其中日本血吸虫和曼氏血吸虫占76.39%，而其他物种的研究相对滞后。具体研究情况见表1。
2.2 将“candidate”作为关键词，用逻辑符“AND”连接“Platyhelminthes”检索，得到109条蛋白。蛋白由于部分标注不清楚或仅有序列的蛋白用BLAST和HMMPfam分析软件进行同源性以及保守区域分析，然后按超家族信息归类。并对部分研究结果不清晰或没有及时更新者进行MEDLINE相关文献查阅，共分17类蛋白。表1 检索到各大数据库扁形动物门各物种的相关蛋白及肽段数目（略）表2 目前检索到扁形动物门各物种中用于候选分子的相关研究及方向（略）表3 检索到扁形动物门各物种中用于靶位蛋白的相关研究及方向（略）
2.3 将“target”作为关键词，用逻辑符“AND”连接“Platyhelminthes”检索，由于部分标注不清楚或仅有序列的蛋白用BLAST和HMMPfam分析软件进行同源性以及保守区域进行分析，然后按照超家族信息归类。并对部分研究结果不清晰或没有及时更新者进行相关文献查阅。
3 讨论
NCBI是为储存和分析分子生物学、生物化学、遗传学研究成果而创建的自动化系统，它的出现使各个实验室能快速有效的获取世界范围内的生物技术信息。Entrez是NCBI为用户提供核酸和蛋白质序列、定位、分类和结构数据的信息检索系统［7］，具有强大的检索功能，包括检索相关的序列、结构和
参考文献
。该系统整合了GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等数据库的序列信息以及MEDLINE有关序列的文献信息，使得子检索系统Protein Entrez能够连接SwissProt，PIR，PRF，PDB等数据库，并通过该连接快速检索世界上最新上传的蛋白数据［8］。本次研究根据这一强大的检索分析系统，运用了信息学的方法，通过高通量的筛选，检索了世界权威数据库收录的目前用于寄生虫诊断、防治等研究的大量蛋白，并对检索到标注不明确或信息未及时更新的蛋白进行同源性比对，蛋白家族归类等分析，共检索到扁形动物门蛋白信息32276条，然后对这些蛋白进行二次检索、分析、分类整理，筛选出目前用于临床的靶蛋白或正在研究中的候选靶蛋白33种，这将给细粒棘球蚴甚至整个扁形动物门寄生虫有价值分子的筛选都提供了研究捷径。本研究表明：曼氏血吸虫和日本血吸虫的研究较多，合计占总数的76.39%，其它寄生虫的研究还比较落后。其中以候选分子为关键词检索，检索出来的蛋白以候选疫苗为主，提示其它寄生虫的疫苗防治研究可以借鉴曼氏血吸虫或日本血吸虫的蛋白候选分子的研究。通过本次研究分析，也进一步证实了国际上和世界卫生组织推荐的候选分子如谷胱甘肽转移酶（GST）、脂肪酸结合蛋白（Fatty Acid-Binding Protein）、细粒棘球蚴95抗原（EG95）等［9-14］，取得了比较好的研究成果。另外，也可以通过查阅其它的已经进行过疫苗方面研究的文献，进一步论证例如filamin、gp18-22等蛋白的细粒棘球蚴同源蛋白是否能作为其疫苗候选分子。在靶位分子研究中，目前研究的分子有药物靶位分子、调节分子靶位、疫苗靶位分子、诊断靶位分子等，对细粒棘球蚴有价值靶位分子筛选提供了参考依据，提供了捷径。
参考文献
［1］McManus DP，Thompson RC. Molecular epidemiology of cystic echinococcosis［J］. Parasitol，2003，127（suppl）: S37-51.
［2］Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs［J］. Nucleic Acids Res，1997，25:3389-3402.
［3］Abola EE，Bernstein FC，Bryant SH，et al. Protein Data Bank. In Crystallographic Databases-Information Content，Software Systems，Scientific Applications Edited by: Allen FH，Bergerhoff G and Sievers R. Bonn/Cambridge/Chester［J］. Dat Commi of IUC，1987，107-132.
［4］Eddy SR. Profile hidden Markov models［J］. Bioinformatics，1998，14: 755-763.
［5］Gough J，Karplus K，Hughey R，et al. Assignment of homology to genome sequences using a library of hidden Markov models that represent all proteins of known structure［J］. J Mol Biol，2001，313: 903-919.
［6］The protein entries of NCBI.http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez?db=protein&&cmd=search&&term=Platyhelminthes，2009.
［7］Entrez cross-database search..http://www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/gquery，2009.
［8］The protein entries of NCBI.http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez?db=protein，2009.
［9］Zhang WB，Li J，Li Q，et al. Identification of a diagnostic antibody-binding region on the immunogenic protein EpC1 from Echinococcus granulosus and its application in population screening for cystic echinococcosis［J］. Clin Exp Immunol，2007，149(1): 80-86.
［10］Zhang W，Zhang Z，Shi B，et al. Vaccination of dogs against Echinococcus granulosus，the cause of cystic hydatid disease in humans［J］. J Infect Dis，2006，194(7): 966-974.
［11］郝慧芳，王志钢，李志伟. 细粒棘球蚴内蒙株FABP基因cDNA的克隆与核酸疫苗的构建［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2007，25(4): 352-354.
［12］Chow C，Gauci CG，Vural G，et al. Echinococcus granulosus: variability of the host-protective EG95 vaccine antigen in G6 and G7 genotypic variants［J］. Exp Parasitol，2008，119(4): 499-505.
［13］李文桂，王鸿，朱佑明. 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2007，25(2): 109-113.
［14］何莉莉，景涛，祝秉东，等. 细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2007，25(4): 320-324.