作者：李丽萍， 刘秀芳， 宁艳花， 刘桂珠， 李春燕
【摘要】 目的 观察邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)对大鼠睾丸能量代谢酶的影响及其氧化损伤作用。方法 将32只健康雄性大鼠随机分为4组，即阴性对照组(玉米油)和DEHP染毒组(375、 750、1500mg·kg-1)。采用经口灌胃的方式重复染毒30d，于末次染毒24h后，取右侧睾丸制备组织匀浆，采用分光光度法测定LDH、SDH、ATPase及SOD、MDA、GSHPx和GSH的活性。结果 随着染毒剂量增加，与对照组比较，SOD活力与MDA含量增高，1500mg·kg-1组差异具有统计学意义(P&<0.05);GSH与GSH-Px活力先增高后降低，GSH-Px活力差异均具有统计学意义(P&<0.01)，GSH活力差异均无统计学意义(P&>0.05);SDH酶活性增高，差异均具有统计学意义(P&<0.01);Na+-K+-ATPase的活性750mg·kg-1组差异具有统计学意义(P&<0.01)，LDH、Ga2+-ATPase 、Mg2+-ATPase活性差异均无统计学意义(P&>0.05)。结论 DEHP可能通过影响睾丸生殖细胞能量代谢及脂质过氧化损伤作用对雄性大鼠睾丸发挥毒性作用，其毒作用特点可能表现为毒物兴奋效应。
【关键词】 邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯;大鼠;睾丸;氧化损伤
邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalatic-acid esters，PAEs))作为增塑剂广泛用于食品包装材料、容器、医疗用品及人造革等方面，其中用量最大的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯[phthalate(2-ethylhexyl)ester，DEHP]，销售量占PAEs总量的40%[1]。DEHP在塑料中以游离的形式存在，重量上可达30%～50%，很容易进入环境，可以在地表水、地下水、饮用水、空气、土壤及动、植物体内广泛检测到，与人类生活密切相关，尤其存在于一些食品包装及医疗器械中，因而人类受危害的可能性较大[2]。目前的研究发现其毒性作用主要是作为内分泌干扰物，表现为生殖生长毒性、肝肾毒性及血液和生化方面的改变。本次研究以雄性大鼠为研究对象，采用经口灌胃的方式染毒，从DEHP对大鼠睾丸生殖细胞能量代谢和氧化损伤作用的角度探讨其生殖毒性作用机制，为进一步研究DEHP及其同类化合物的雄性生殖毒性作用机制提供研究基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康雄性大鼠[清洁级，宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(宁)2005-0001，动物房合格证号SYXK(宁)2005-0001]32只，体重280～320g。
1.2 试剂 DEHP(国药集团化学试剂有限公司)，玉米油(市售)，考马斯亮蓝测定蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、ATPase测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
1.3 实验动物分组与染毒
将32只健康雄性大鼠随机分为四组，每组8只，即DEHP 染毒组(375、750、1500 mg·kg-1)和阴性对照组(玉米油，0.4 mL/100g)，采用经口灌胃重复染毒的方式，每天染毒1 次，每周染毒5d，连续染毒30d，实验期间，大鼠自由饮水、进食。于末次染毒24h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心尖采血处死大鼠，取右侧睾丸组织称重，制备睾丸组织匀浆待测。
1.4 观察指标及测定方法
1.4.1 观察DEHP对雄性大鼠体重增长量的影响 染毒期间，每7d称量体重1 次，观察不同剂量染毒组大鼠体重增长变化情况。
1.4.2 DEHP对雄性大鼠睾丸和附睾脏器系数的影响 取双侧睾丸、附睾称重后与体重的比值即为脏器系数。
1.4.3 DEHP对大鼠睾丸组织氧化损伤指标的测定 GSH-Px、GSH、SOD、MDA的测定均按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。
1.4.4 DEHP对大鼠睾丸能量代谢酶的测定 LDH、SDH、ATPase的测定均按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。
1.5 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件对结果进行分析，结果用(±s)表示，采用one-way-ANOVA的方法对结果进行统计学分析，α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况观察
染毒期间，各剂量染毒组大鼠体重增长量与对照组比较，差异均无统计学意义(P&>0.05)，见表1，各组大鼠均未见明显中毒症状。表1 DEHP染毒对大鼠体重增长量的影响
2.2 DEHP染毒对睾丸和附睾重量的影响
DEHP染毒组大鼠睾丸和附睾脏器系数与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P&>0.05)，见表2。表2 DEHP染毒对雄性大鼠睾丸和附睾 重量的影响
2.3 DEHP染毒对大鼠睾丸组织匀浆脂质过氧化的影响
DEHP染毒28 d后，随染毒剂量增加，大鼠睾丸组织SOD活力呈现逐渐上升的趋势，且高剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P&<0.05);MDA随着染毒剂量的增加，呈明显上升趋势，高剂量组与对照组相比差异有统计学意义(P&<0.05);GSH-Px随着染毒剂量的增加，呈先升高后下降趋势，与对照组比较，各染毒组差异均有统计学意义(P&<0.01);GSH随着染毒剂量的增加，呈先上升后下降的趋势，低剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，见表3。表3 DEHP染毒对大鼠睾丸组织匀浆脂质过氧化的影响
2.4 DEHP染毒对性成熟大鼠睾丸标志酶活性的影响
由表4可见，DEHP各染毒组LDH活性与对照组比较差异均无统计学意义;各染毒组睾丸组织匀浆中SDH酶活性与对照组比较差异具有统计学意义(P&<0.01);Na+-K+-ATPase活性与对照组比较750 mg·kg-1组差异具有统计学意义(P&<0.01)，Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase的活性差异均无统计学意义。表4 DEHP染毒对大鼠睾丸能量代谢酶活性的影响
3 讨论
孙俊红等[3]测定了包括医用输液袋、保鲜膜、一次性塑料袋等塑料制品浸出液中DEHP的含量，结果表明，仅一次性塑料袋中可检测出DBP的含量为91.45 μg·kg-1，据美国毒物与疾病登记署(ATSDR)估算，普通人群对DEHP的最大日接触量为2 mg·d-1，但职业性或医源性的接触量更高。比如，输血时的接触量可高达250～300 mg，相当于体重70kg成年人的日接触量3.5～4.3 mg·kg-1。对于代谢清除能力较弱的婴幼儿来说，接触量将会更高。德国研究协会于2004年3月发布的新闻公报中说，人体对邻苯二甲酸酯类化学物质的摄入量远比原先预测得要多，儿童尤其如此，过去几十年来男性精子数量持续减少、生育能力下降可能与吸收越来越多的邻苯二甲酸酯有关[4]。
宁夏医科大学学报32卷
在本次研究设计的染毒剂量范围内，各染毒组大鼠体重及睾丸/体重系数、附睾/体重系数与对照组比较差异均无统计学意义，大鼠均未见任何毒作用表现，表明该剂量范围内DEHP对大鼠还未能产生明显的毒性作用。
在正常的生理情况下，机体中的抗氧化防御系统与机体产生的活性氧处于一个动态的平衡中，当机体受到外部有害因素的影响，这种平衡就可能破坏，表现为活性氧过多或抗氧化剂减少，活性氧堆积可以产生进行性的脂质过氧化并最终损伤细胞。SOD是机体抗氧化防御系统中的重要酶，具有清除超氧自由基，间接抑制脂质过氧化和膜损害的作用，常用来间接反映氧自由基的水平以及细胞抗脂质过氧化和清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化的一种最终产物，其含量的多少可反映组织中脂质过氧化的速率和强度，可间接反映自由基的水平和细胞氧化损伤的程度[5]。体内GSH能自行或经GSH-Px催化过氧化氢和过氧化脂质的还原，消除自由基造成的损伤，是细胞抵抗活性氧损害的主要物质。GSH较敏感，其含量的变化可综合反映组织细胞抗氧化损伤的能力[6]。本次研究结果显示：随着染毒剂量增加，大鼠睾丸组织匀浆中，SOD活力上升，与对照组比较，1500 mg·kg-1组差异有统计学意义(P&<0.05);MDA含量增高，1500 mg·kg-1组差异有统计学意义(P&<0.05);GSH与GSH-Px活力均表现为低剂量时增高，高剂量时降低，与对照组相比，各染毒组GSH-Px活力差异均具有统计学意义(P&<0.01)，各染毒组GSH活力差异均无统计学意义(P&>0.05)，见表1。表明在该剂量范围内，DEHP对睾丸组织表现了毒物兴奋效应(hormesis)，即在一定剂量水平，机体处于清除毒物和自我保护状态(代偿期)，表现为抗氧化损伤指标活性(SOD、GSH、GSH-Px活力)不同程度增高，继而随着剂量的继续增加，超过了机体的代偿范围，其活性又表现为下降趋势。由此可见DEHP可以通过脂质过氧化作用对大鼠睾丸发挥毒性作用。
LDH主要存在于精母细胞、精子细胞胞质及精子尾中段线粒体上，催化丙酮酸转化为乳酸进行无氧代谢，是生精细胞糖代谢生能的主要酶，其活性与生精过程及精子活动、获能及受精有关，可作为预测生精能力的重要指标[7]。该酶活性受到抑制，将阻碍能量的供给，逐渐导致细胞的变性。SDH是生精细胞和精子进行有氧呼吸的关键酶，与精子的发生成熟密切相关。在睾丸组织中，SDH主要分布于生精小管和精细胞的线粒体内，在精子的能量代谢中起重要作用，可作为精子功能成熟和形态完善的标志酶[8]。本次研究结果显示：随着DEHP染毒剂量增高，LDH的活性有降低趋势，但与对照组比较，差异均无统计学意义，提示在该剂量范围内，DEHP对生精细胞的无氧代谢还未产生明显的影响，但随着剂量的增加，DEHP可能会通过影响LDH的活性，进而造成生精细胞能量供应不足，使生精能力降低。各染毒组睾丸组织匀浆中SDH酶活性均有不同程度增高，与对照组比较差异具有统计学意义(P&<0.01)，表明在该剂量范围内，DEHP可能通过影响生精细胞和精子进行有氧呼吸过程中的能量代谢，机体出于自我保护，为了抵抗这种不利因素的影响，代偿性表现为SDH酶的活性不同程度增强，但随着剂量增高，其活性增强的程度呈降低趋势，表现为机体对抗DEHP产生的有害影响的能力下降，如果染毒剂量增大，机体将可能表现为失代偿，SDH酶活性进一步降低，此过程产生的效应可能会影响睾丸生精细胞的生精过程及精子的结构和功能。
作为组织细胞能够直接利用的唯一能源，ATP的合成和分解是机体内能量转移和利用的关键环节。ATP的分解是在ATPase作用下进行的。ATPase既可影响产能过程，又关系到能量的转移和利用，所以其活性是反映机体能量代谢水平的一项重要指标。ATPase是睾丸内能量代谢的标志酶，其活性的降低则是细胞膜受损的标志之一，与缺氧、酸性代谢产物以及氧自由基生成有关，Na+-K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase在细胞运动、收缩、代谢调节中也有重要作用。本次研究结果显示：在该实验剂量范围内，DEHP可影响Na+-K+-ATPase的活性，与对照组比较750 mg·kg-1组差异具有统计学意义(P&<0.01)，Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase的活性均无统计学意义，提示DEHP可通过干扰雄性生殖细胞对能量的利用，进而对生殖细胞产生损伤作用。
综上所述，在该剂量范围内，DEHP对雄性生殖细胞的毒性作用一方面可能是通过脂质过氧化作用发挥其毒性作用，另外一方面可能是通过影响了生精过程及睾丸内的能量代谢来发挥其毒性作用的，其毒作用特点可能表现为毒物兴奋效应，即在低剂量表现为兴奋效应，而在高剂量时则表现为抑制作用。
参考文献
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[3] 孙俊红，张克荣，吴德生，等.一次性使用塑料制品中邻苯二甲酸酯的含量[J].环境与健康杂志，2002，19(4)：314-315.
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