作者：肖旭 姚青 王基云 李晓兵 陈虎 张焱 芦晓红 高岭
【摘要】 目的 探讨甘珀酸钠(carbenoxolone sodium，CS)对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 昆明种小鼠60只随机分为6组，各组分别每天给予不同剂量(160、80、40 mg·kg-1)的CS和联苯双酯滴丸(200 mg·kg-1)灌胃，对照组和模型组给予生理盐水。7d后，除空白对照组外各组小鼠皮下注射0.1%CCl4制备急性肝损伤模型，16h后取血检测血清ALT、AST活性;测定肝组织匀浆中MDA含量和SOD、GSH的活性及观察肝脏病理学变化。结果 CS(160、80 mg·kg-1)能降低CCl4所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性(P&<0.01)，降低肝脏MDA的含量(P&<0.01)，增强GSH和SOD活力(P&<0.01，P&<0.05)，并能明显改善肝组织的病理学损伤。结论 CS对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有保护作用。
【关键词】 甘珀酸钠;急性肝损伤;四氯化碳
甘草是一味重要的传统中药，其主要成份甘草次酸及其衍生物具有广泛抗炎、抗溃疡、抗肿瘤、调节机体免疫力等药理作用[1-4]。甘珀酸钠(carbenoxolone sodium，CS)是甘草次酸的半琥珀酸酯二钠盐，其抗溃疡的效果较好[5]，国内外对其肝保护作用的研究报道较少。本实验旨在观察甘珀酸钠对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用，初步探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 清洁级健康昆明种小鼠，雄性，体重(20±2)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2005-0001。
1.1.2 药品与试剂 甘珀酸钠(由宁夏大学化学化工学院提供)，联苯双酯滴丸(biphenyl dimethyl dicarboxylate，BDD，浙江万邦药业有限公司，批号0701003，临用前用生理盐水配至所需浓度)，CCl4(郑州市化学试剂三厂，分析纯，批号990923，用时以精制橄榄油配制成0.1%溶液)，多聚甲醛(天津市福晨化学试剂厂，批号20080112)，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷光甘肽(GSH)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.3 主要仪器 分析天平(METTLER TOLEDO瑞士)721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温离心机(日立公司 CF16RX);电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司DK-S14)。
1.2 方法
1.2.1 CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立[6]将小鼠随机分成6组，每组10只。分别为正常对照组、CCl4模型组、联苯双酯滴丸组(200 mg·kg-1)、CS160、80、40 mg·kg-1 组。灌胃给药，容量0.1mL·10g-1，模型组和空白组分别灌胃给予同体积生理盐水，每天1次，连续给药7d。于末次给药2 h后，皮下注射0.1% CCl4橄榄油溶液，10 mL·kg-1，正常对照组皮下注射等容量的橄榄油溶液，禁食，不禁水。造模16 h后，摘眼球取血，3000 r·min-1离心10min，取血清超低温冰箱冻存，待测。采血后，快速断头处死，取肝右叶组织0.5g，在冰生理盐水中漂洗，滤纸拭干，用生理盐水制成10%肝组织匀浆，离心，取上清待测。同时取左叶相同部位肝脏，4%多聚甲醛固定做病理切片。
1.2.2 测定指标 血清ALT、AST(化学比色法);肝组织匀浆SOD(羟胺法)、MDA(TBA法)和GSH(比色法)均按试剂盒要求测定;取肝左叶同一部位组织，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织的形态学变化。
1.3 统计学方法 数据均以(±s)表示，用SPSS统计软件处理数据，样本均数间比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清生化指标检测
CS各剂量组均可使CCl4所致小鼠血清中升高的ALT、AST活性降低(P&<0.05)，呈剂量依赖性。结果见表1。表1 CS对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响
2.2 肝组织匀浆生化指标检测
与正常对照组比较模型组小鼠肝组织中MDA含量明显升高(P&<0.01)，SOD与GSH活性显著下降(P&<0.01)，提示肝脏出现脂质过氧化。而CS 160、80mg·kg-1组可显著抑制肝组织中MDA的升高(P&<0.01)，并使SOD、GSH活性明显升高(P&<0.05)，提示CS有较强的抗氧化及清除氧自由基的作用，结果见表2。
2.3 肝脏组织病理学观察
正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地软而有弹性;光镜下可观察到肝小叶结构完整，细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，无炎细胞浸润。模型组小鼠肝脏体积增大，质脆，边缘钝而厚，表面呈黄褐色;镜下见肝小叶结构破坏，肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和大量炎细胞浸润。联苯双酯组和甘珀酸钠高剂量组肝脏略有水肿，质地柔软;镜下见肝小叶结构基本完整，细胞排列较整齐，只有少量的炎细胞浸润，较模型组有明显改善;甘珀酸钠中剂量组与模型组相比有所改善，甘珀酸钠低剂量组与模型组相比无明显变化(图1，见插页3)。表2 CS对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA和GSH的影响
3 讨论
在肝细胞病变过程中，自由基、酶及脂质过氧化等均发挥重要作用[7]。CCl4是诱导化学性肝损伤的常用药物，在体内经肝脏细胞色素P450激活生成三氯甲基自由基(·CCl3)、二氯甲烷自由基(·CCl2)等，引起细胞膜的脂质过氧化，使肝细胞膜通透性增加，引起肝细胞严重受损，细胞内转氨酶易穿过细胞膜而释放入血液[8]。因此，血清转氨酶活性升高是肝细胞受损的敏感指标。SOD和GSH是细胞内主要的抗氧化酶，可清除自由基，激活或调动机体中的内源性抗氧化系统，预防或减轻自由基损伤。自由基是启动脂质过氧化的关键因素，其含量越高则肝损伤程度就越严重，SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，可抑制自由基启动的脂质过氧化，MDA是脂质过氧化降解的主要产物，MDA能使膜蛋白、酶发生交联反应，使膜通透性增加，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，对机体造成损害，其含量反映了组织脂质过氧化损伤程度。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[9-10]，因此SOD及MDA可反映肝细胞损伤的程度和药物对肝细胞的拮抗作用。GSH广泛存在于人体的各种组织中，GSH水平降低意味着机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应，产生大量的自由基。在肝脏化学性损伤时，氧化应激消耗GSH引起肝脏GSH含量下降，机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应[11]。实验结果显示甘珀酸钠可降低肝组织MDA的含量，并提高了SOD和GSH的活力。
甘珀酸钠能够维持细胞膜结构和功能的完整性，阻止肝细胞的损伤破坏，抑制相关酶的升高;并抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用，提高机体清除氧自由基能力，从而对CCl4引起的化学性肝损伤起到一定的保护作用，对甘珀酸钠作用机制还有待进一步深入研究。
参考文献
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