作者：王海全， 高锋利， 李昭宇， 王娅娜
【摘要】 目的 研究人RUNT相关转录因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)和DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)在原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达及其与临床病理学特征的关系，并探讨其临床意义。方法 应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR)检测43例HCC患者癌组织及其相应癌旁组织中RUNX3 mRNA、DNMT1 mRNA的表达。结果 肝癌组织中RUNX3表达明显降低，DNMT1表达增高;RUNX3表达下调与组织分化程度有关(P&<0.05)，而与性别、年龄、HBsAg、AFP、静脉癌栓及TNM分期均无明显关系(P&>0.05);DNMT1表达升高与静脉癌栓、组织分化程度及TNM分期有关(P&<0.05)，而与性别、年龄、HBsAg、AFP均无明显关系(P&>0.05)。RUNX3与DNMT1表达成负相关(r=-0.2059，P&<0.05)。结论 RUNX3基因在肝癌组织中表达下调，DNMT1表达增高，可能与肝癌的发生发展有关;高表达的DNMT1在一定程度上参与调控RUNX3基因的表达下调。
【关键词】 原发性肝细胞癌;RUNX3;DNMT1;逆转录聚合酶链反应
原发性肝癌(HCC)是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，具有多中心、浸润性生长、易复发、预后差等特点，近年来从分子水平判定原发性肝癌的预后和复发问题成为研究的热点。RUNX3基因是近年新发现的抑癌基因，近来的研究证实许多肿瘤中可检测到RUNX3基因的表达下调甚至缺失[1]。DNA 甲基化酶1(DNMT1)是体细胞中最丰富的甲基转移酶，在多种实体肿瘤和造血系统肿瘤中表达增高[2]。目前国内尚未见肝癌组织中同时检测RUNX3、DNMT1 表达活性状态的相关研究报道，本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测肝癌组织及相应癌旁组织中RUNX3 mRNA 、DNMT1 mRNA 表达情况，并初步探讨其与肝癌患者临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 标本 43例原发性肝癌和其对应的癌旁组织取自宁夏医科大学附属医院2008年4月-2009年6月的手术切除标本，癌组织取自肿块中央非坏死部分，对应癌旁组织取自距肿瘤边缘2cm以上，组织离体后立即放于液氮中速冻，-80℃冻存备用。所有患者术前均未行任何抗癌治疗，临床资料完整，所有病例均经病理学证实。其中男35例，女8例，年龄25～70岁，平均(52.35±9.27)岁，中位年龄54岁。TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期28例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例。病理分级：高分化26例，中分化10例，低分化7例。
1.2 试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司。RT-PCR一步法反应试剂盒购自Promega公司。PCR引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 RNA提取及一步法RT-PCR 取组织100mg，彻底匀浆后按Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计量后，取2μg RNA按照试剂盒说明比例配制50μL反应体系。RUNX3引物 上游5'-TCT GCT CCG TGC TGC CCT CGC ACT G-3'，下游5'-AGG CAT TGC GCA GCT CAG CGG AGT A-3'，扩增长度152bp;DNMT1引物 上游5'-CCC CTG AGC CCT ACC GAA T-3'，下游5'-CTC GCT GGA GTG GAC TTG TG-3'，扩增长度 142bp;β-actin引物 上游5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3'，扩增长度258bp;制备2%琼脂糖凝胶，电泳，紫外分析仪下观察，凝胶图像分析系统拍照，并进行半定量分析。表达量的相对值=待测基因扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。
1.4 统计学方法 数据以均数±标准差(±s)及百分率(%)表示，采用SPSS 11.5 统计软件进行统计学处理，计量资料的比较用两样本t检验，两样本率的比较采用χ2 检验，RUNX3 mRNA与DNMT1 mRNA 表达之间的相关性比较采用Spearman相关分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RUNX3 mRNA、DNMT1 mRNA在肝癌、癌旁组织中的表达情况
43例患者中，β-actin mRNA在癌组织、癌旁组织中均表达，见图1。RUNX3 mRNA表达肝癌组织低于癌旁组织(P&<0.05)，见表1、图2。DNMT1 mRNA表达肝癌组织高于癌旁组织(P&<0.05)，见表1、图3。
RUNX3 mRNA表达率肝癌组织低于癌旁组织(χ2=4.778，P&<0.05)，见表2。DNMT1 mRNA表达率肝癌组织高于癌旁组织(χ2=4.674，P&<0.05)，见表3。表1 RUNX3、DNMT1 mRNA在肝癌、癌旁组织中的表达均值表2 RUNX3 mRNA、 DNMT1 mRNA在肝癌、癌旁组织中的表达率
2.2 RUNX3 mRNA、DNMT1 mRNA在肝癌中的表达与临床病理特征之间的关系
RUNX3 mRNA表达率与性别、年龄、HBsAg、AFP、肿瘤大小、静脉癌栓及TNM分期无明显关系(P&>0.05)，与组织分化程度有关(P&<0.05)，见表4。DNMT1 mRNA表达率与性别、年龄、HBsAg、AFP、肿瘤大小无明显关系(P&>0.05)，与静脉癌栓、TNM分期及组织分化程度有关(P&<0.05)，见表4。
2.3 DNMT1 mRNA 与RUNX3 mRNA表达的相关性
Spearman 相关分析显示肝癌组织中DNMT1 mRNA 与RUNX3 mRNA的表达具有负相关性(r=-0.2059，P&<0.05)。
3 讨论
原发性肝细胞癌在我国的发病率居恶性肿瘤第三位，预后较差。研究表明，癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是HCC发生、发展的分子生物学基础。积极寻找肝癌早期诊断和预后的分子标记物，才能最终达到彻底根治肝癌的目的。表4 RUNX3 DNMT1 mRNA表达与肝癌临床病理特征的关系RUNX3基因是近年新发现的肿瘤抑制基因，位于染色体1p36，其编码的RUNX3蛋白是β型转化生长因子(transforming growth factors-β，TGF-β)信号通路下游的一个转录因子。在RUNX蛋白(包括RUNX3蛋白)的指导下，Smad复合物才能从细胞质内转入特定的靶位点[3]，当RUNX 基因表达受抑制时，影响TGF-β抑制肿瘤信号通路的转导，从而诱导肿瘤的发生。已知在大多数肿瘤的发生发展中存在RUNX3基因失活。有文献报道原发性肝细胞癌在1p36位点存在高频率的等位缺失[4]，由于RUNX3基因正好位于1p36位点，推测肝细胞癌的发生发展可能涉及到RUNX3基因的改变。大量实验已证实，多种抑癌基因因高甲基化而失活[5]，肝细胞癌存在严重的DNA甲基化紊乱。RUNX3基因5'端启动子及附近存在CpG岛，这种结构表明该基因受甲基化的调控[6]。
肖文华等[7]发现，30.6%(11/36)的肝癌患者存在RUNX3的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，54.4%(49/90)的患者存在 RUNX3的高甲基化，且11例存在LOH的肝癌中有9例存在高甲基化，同时发现RUNX3的LOH与门静脉癌栓、肝内转移和微血管受侵有关。Park等[8]专门研究了肝癌中RUNX3的甲基化状态及其与重要临床病理参数之间的联系，发现40%(4/10)的癌细胞系和 41.1%(30/73)的肝癌患者中都存在RUNX3的甲基化，并与组织学分级、微血管浸润和临床分期密切相关，甚至认为RUNX3的甲基化是发生在肝癌形成早期的重要事件。以上研究均提示RUNX3基因可能作为一个关键性的肿瘤抑制基因，参与了肝癌的发生和发展，它在肝癌中的主要失活机制为启动子区高甲基化和LOH。
在DNA甲基化的过程中，DNMTs起了重要的作用。DNMT1主要作为一种维持性的甲基转移酶，具有转录抑制蛋白质的功能，也参与抑癌基因的沉默，使细胞进入S期及促进细胞增殖。近来已经有报道证实在很多肿瘤组织中如直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤等都存在着不同程度的DNMT1高表达[3-9]。DNMT1活性的增高可能是肿瘤发生过程中的重要步骤[10]。
本实验采用RT-PCR法发现53.49%(23/43)的原发性肝癌组织中RUNX3 mRNA表达缺失，表达率明显低于癌旁组织，其表达与组织分化程度有关，提示RUNX3表达失活可能与肝癌的发生发展有关，参与肝癌的恶性演变，与HCC的预后密切相关，这与刘瑞等[11]，Mori等[1]的实验结果一致。58.13%(25/43)的原发性肝癌组织中DNMT1 mRNA表达升高，表达率明显高于癌旁组织，其表达与TNM分期及组织分化程度、静脉癌栓有关，提示DNMT1在HCC的肿瘤发生、发展中可能起了重要的作用，可能是通过血管侵犯等途径进而导致HCC恶性演变，这与Saito等[12]报道的结果相符。
本实验还发现HCC中RUNX3与DNMT1表达存在负相关，提示高表达的DNMT1和DNA甲基化可能在一定程度上影响RUNX3转录失活。
由于DNA甲基化是一种可逆性过程，目前针对基因去甲基化的分子靶向治疗已引起人们的关注。5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是DNMT1抑制剂，是一种脱氧胞苷类似物，可以降低癌细胞抑癌基因的高甲基化状态。作为一种去甲基化治疗恶性肿瘤的新型代表药物，5-Aza-CdR可降低抑癌基因启动子区域的高甲基化，恢复抑癌基因活性。据Park等[8]报道，SNU2368 等肝癌细胞系经DNMT 抑制剂5-Aza-CdR处理后，RUNX3 基因表达明显增强。在HCC 患者中，我们也许可以以RUNX3 等抑癌基因为治疗靶点[13]，应用DNMT 抑制剂(如ecitabine、fazarabine、zebularine 等)或其与顺铂等抗肿瘤药物联合用药，这还有待进一步深入研究。
参考文献
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