作者：徐华 何毅 张鸣号 李桂忠 曹军
【摘要】 目的 为了研究链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导大鼠1型糖尿病模型的方法并观察糖尿病并发症指标的变化。方法 采用一次性腹腔注射STZ(60mg·kg-1)，监测不同时点大鼠的空腹血糖、体重、饮水量及血浆中的丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等指标。结果 大鼠注射STZ 60mg·kg-1 72 h后血糖值达到成模标准，并逐渐出现糖尿病表现，观察7周，始终满足成模标准，未见转复。糖尿病组大鼠肾脏及肝脏肥大指数较对照组增加(P&<0.01)。糖尿病组大鼠较对照组相比血浆中脂质过氧化产物MDA 水平升高，而SOD 和NO 水平下降(P&<0.01)。结论 本实验1型糖尿病模型大鼠造模成功且模型稳定，并出现了并发症发生的部分指标变化。
【关键词】 1型糖尿病;大鼠模型;血糖
近年来，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升的趋势，心血管、肾脏、视网膜等并发症日趋严重。1型糖尿病及其并发症的病因、发病机理尚未完全阐明，预防和治疗仍不完善，因此建立较理想的动物模型对研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前，国内外普遍使用链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病动物模型，但成模时间从48 h 至2个月不等[1-4]，模型的稳定性也无权威报道。本实验主要针对这一模型的制备方法进行探讨，并测定与糖尿病并发症的发生相关的部分指标。
1 材料与方法
1.1 实验动物选择和喂养 雄性Sprague-Dawley 大鼠，体重120～160g，清洁级，由宁夏医科大学实验动物中心提供。饲养室内通风良好，室温18～25℃，相对湿度40%～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环，饲养时间为9～11月份。自由摄食、饮水。
1.2 主要试剂和设备 STZ(Sigma公司);微量血糖测定仪，美国强生稳豪(配套血糖试纸);MDA、SOD及NO测试盒均购自南京建成生物技术有限公司;其余试剂均为市售分析纯。RC5C高速低温冷冻离心机(美国，Sorvall);Sartorius电子分析天平(德国);pH 计(型号PB220，德国塞多利斯)。
1.3 STZ 液配制 将STZ 溶解于0.1 mol·L-1、pH 4.5(pH 计检测)、无菌的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，制成浓度为12 mg·mL-1(1.2%)的STZ液。其中，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液是由0.1 mol·L-1 柠檬酸母液和0.1 mol·L-1 柠檬酸三钠母液按体积1.2∶1.3 混合摇匀而成。
1.4 实验分组和模型建立 雄性SD大鼠，所有大鼠适应性喂养1周，药物注射前观察大鼠健康状况，1周内饮食正常、体重不减轻、血糖正常者即可用于实验。取上述大鼠20只(体重120～160g)随机分为两组(每组10只)：糖尿病模型组和正常对照组。实验前动物禁食12h，模型组一次性快速腹腔注射STZ 液(60mg·kg-1);对照组腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。72h 后血糖值≥16.67 mol·L-1 为模型组大鼠[5]。
两组大鼠常规饲养，自由摄食、饮水。模型处理7周后，禁食12h 测定血糖值，乌拉坦1 g·kg-1 腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用做下述测定;称取全肝、双肾、心脏重量，计算肝/体重比、双肾/体重比及心/体比值。
注意事项：①STZ 液和柠檬酸缓冲溶液必须低温(4℃)保存，新鲜配制;STZ 液须避光保存，5min 内用完。②大鼠禁食12 h 后注射STZ，注射后给予充足饮水及食物，每日换垫料1～2 次，保持干燥。③采血部位涂以抗生素软膏，防止感染。④注射STZ 后早期不宜较大量采血，因其可增加应激因素，影响结果。
1.5 观察指标和检测方法
1.5.1 成模状况及血糖检测 根据注射STZ 72h 后血糖值≥16.67 mol·L-1 为判断模型组大鼠模型的标准，计算成模率，并计算成模7周后大鼠的病死率。剪断尾尖取血，用血糖仪检测注射前(0 d)及注射后3、7、14、28、42d 和49d两组动物的血糖值。
1.5.2 一般情况 定时观测大鼠体重、精神状态、形态、毛色、饮食饮水量、尿量等，实验结束时计算大鼠肝/体重、双肾/体重及心/体重比值(肥大指数)。
1.5.3 并发症相关指标测定 按测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)试剂盒说明书，测定血浆中的MDA、SOD 及NO 等指标。
1.6 统计学方法
数据以均值±标准差(±s)表示，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成模状况及血糖水平
本次实验10只大鼠均造模成功，成模后饲养7周，大鼠无一死亡。造模后模型组血糖值一直维持在高水平，较对照组差异有统计学意义(P&<0.01)，且模型组大鼠血糖自第2周起至第7周期间各检测点之间血糖差异无统计学意义(P&>0.05)，见表1。表1 实验组与对照组大鼠血糖检测
2.2 一般情况
对照组大鼠体形适中，精神状况良好，反应灵敏，动作敏捷，毛发光泽;模型组大鼠消瘦，腹部明显肥大、呈典型蛙状腹表现，精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，毛发黄干欠光泽，易脱毛，饮水量、进食量、尿量显著增多。实验前两组间体重差异无统计学意义;诱发糖尿病后，模型组体重明显低于对照组(P&<0.01)，见图1、表2。模型组肾脏、肝脏肥大，相对肾重及肝重分别较对照组高98.10%和49.59%(P&<0.01);而模型组相对心脏重量与对照组差异无统计学意义(P&>0.05);模型组饮水量较对照组高5.27倍(P&<0.01)，见表2。
2.3 模型组 并发症相关指标测定
模型组大鼠血浆中MDA水平较对照组 组高55.23%，SOD和NO水平分别较对照组降低11.11%和18.11%，且与对照组相比差异均有统计学意义(P均&<0.01)， 见表3。表3 大鼠血浆丙二醛、超氧化物歧化酶和一氧化氮的变化
3 讨论
大鼠糖尿病模型的制备现多采用STZ 诱导，其对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用[6]。较大剂量STZ 诱导糖尿病大鼠其机制是破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭，血糖明显升高，临床表现与人类1型糖尿病类似。STZ 诱导的糖尿病因给药方式、剂量不同，其成模效果也有所差别。由于STZ 稳定性差，配制后须立即使用方能产生良好效果。本实验从简单、有效考虑，采取一次性快速腹腔内注射STZ 液(60mg·kg-1)，雄性大鼠在注射72h 后，100%血糖值超过1型糖尿病成模标准(16.67 mol·L-1);观察7周，大鼠血糖持续偏高，且无一死亡。大鼠在注射STZ 后，逐渐出现饮水、进食及尿量增多、消瘦、脱毛、活动减少等表现，这些均与以往报道相符[7]。本实验发现模型组大鼠肾重/体重之比(肾脏肥大指数)明显高于对照组，提示糖尿病肾脏肥大，与文献报道一致[8];同时有肝脏肥大指数增加表现，与对照组相比差异有统计学意义，提示糖尿病肝脏亦有肥大表现。本实验通过多次STZ 制备1型糖尿病大鼠模型，实践证明该制作方法操作方便、重复性强、成功率高，是制作1型糖尿病大鼠模型较理想的方法，为糖尿病的实验研究提供了一种简便、有效、稳定、适用的动物模型。
一系列动物实验及临床研究均已证实血糖增高是引起氧化应激的重要原因，它还可直接引起肾小球系膜细胞的氧化应激增强。自由基增加在糖尿病慢性并发症方面尤为重要。MDA 的含量可反映脂质过氧化的速度和强度，间接反映出细胞受损的程度。SOD 等为机体抗氧化防御系统，可清除自由基，保护机体脏器免受损害。本实验模型组大鼠的MDA 明显高于对照组，而作为抗氧化酶系统的SOD 显著降低。虽然不能确切反映二者间因果关系，但自由基生成增多的事实，与文献报道一致[9]，表达了糖尿病时的氧化应激亢进，抗氧化能力降低。氧化应激参与微血管病变的发生，MDA 升高及SOD 降低是糖尿病合并视网膜和肾脏病变等的重要因素之一，是微血管并发症的重要环节，测定血浆MDA、SOD水平也许可以反映糖尿病患者微血管病变的程度。
NO由左旋精氨酸经NO合成酶作用而产生。糖尿病时因高糖而引起生理生化改变使NO 无法正常发挥激活可溶性鸟苷酸环化酶的作用，血鸟苷酸环化酶(cGMP)降低，后者的扩张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、血管重建、抑制血小板的活化、黏附和聚集等生物学效应被抑制。本实验发现，模型组大鼠血浆NO 水平明显低于对照组。亦有研究报道[10]，糖尿病时伴高血压、动脉硬化及内皮细胞损伤，致NO 生成减少，NO 减少可增加血小板聚集、黏附及血管平滑肌增殖。张芬莲等[11]认为由于血、尿 NO-2+NO-3及cGMP 的改变并不是因短期血糖波动的结果，而是一个较长期的过程，所以测定NO 和cGMP 可以预测微血管病变的发生，尤其是糖尿病肾病的发生发展。
本实验结果进一步表明STZ 诱导的糖尿病大鼠不仅抗氧化的防御体系受到损伤，而且氧化应激也增强，NO 水平降低。定时观测MDA、SOD及NO 可作为发现糖尿病慢性并发症的指标之一。对已有慢性并发症患者给予抗氧化剂，可望减少自由基的产生和堆积，减轻缺氧组织和脏器损害。
参考文献
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