关于形状对构建组织工程化心肌组织的影响

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　　　　　　　　 作者：张环，常海霞，赵志敬，辛渭川

【摘要】 　　目的： 探索形状（片层及条带）对构建工程化心肌组织（EHT）的影响. 方法： 原代心肌细胞与液态胶原，Matrigel， 2×DMEM混合，注入环形槽内形成心肌条带，注入方形槽内形成心肌片层，条带和片层培养1 wk后行力学拉伸，继续培养1 wk，行HE染色，鞣酸多彩(mason)染色，免疫组化染色以及激光共聚焦检测等对EHT进行评价. 结果： 拉伸前，心肌片层和心肌条带均可见点状自发性跳动，心肌片层拉伸后2 d 出现肉眼可见的一致性节律性跳动；心肌条带拉伸后4 d 形成肉眼可见的一致性跳动，14 d 后心肌条带仍然能维持长时间的跳动，形状和大小无明显改变，而心肌片层在去除力学拉伸后，发生明显的回缩，收缩力量减弱. HE 染色，mason染色，免疫组化以及激光共聚焦检测结果显示，EHT 拉伸后内部细胞均匀分布，沿拉伸方向伸展， 细胞核完整，呈长梭形，含有丰富肌丝，与正常成年大鼠心肌组织类似. 结论： 片层和条带对构建EHT各有利弊. 心肌片层易于构建，容易移植，但构建后生理性能不稳定，而心肌条带构建后生理性能较稳定，但构建成功率低.
【关键词】 原代心肌细胞；胶原I型；组织工程；心肌；片层；条带
　　【Abstract】 AIM: To sudy the effect of shape（patch and ring）on the construction of engineered heart tissue(EHT). METHODS: Liquid collagen type I， Matrigel and 2×DMEM were mixed with neonatal rat cardiac myocytes. The mixture was then infused into square molds to construct cardiac patches or infused into circular molds to construct cardiac rings. Seven days later， the EHTs were subjected to dynamic stretch for another 7 d. Light microscopy and transmission electron microscopy， routine HE staining， Mason’s three color staining and immunohistochemical staining were used to analyze the EHTs. RESULTS: Spontaneous beating was seen in the EHTs before stretching. The engineered patches came to rhythmic synchronous beating at the 2nd day after stretching. The engineered cardiac rings finally came to synchronous beating at the 4th day after stretching. After 14 d， cardiac rings hadnt any changes， but cardiac patches reduced in size， and systolic force of cardiac patches dropped. HE staining， immunohistochemical staining and confocal laser scanning microscopy revealed that cardiac myocytes within EHT and construction of EHT resembled that of the native adult cardiac tissue in morphology and construction. CONCLUSION: Cardiac rings and cardiac patches have both advantages and disadvantages. Cardiac patche is easier to construct and transplant， but its physiological characteristics are unstable; cardiac rings physiological characteristics are stable， but its difficult to construct.
　　【Keywords】 primary cardiac myocyte; collagen type I; tissue engineering; myocardium; patch; ring
　　 0引言
　　心脏疾患已成为当今社会的头号杀手，心肌细胞受损和缺如是心脏疾病中最常见的病理改变，而成年心肌细胞为高度分化的终末细胞，不能再生. 近年来针对心肌修复的研究主要集中在细胞注射治疗，但随着组织工程领域的发展，使工程化心肌组织（engineered heart tissue， EHT）成为可能. 与单纯细胞移植治疗相比，EHT具有明显的优势，为此，国内外的学者们开始了EHT的实验研究，以期替换已病变的心肌组织. 在这些研究中对形状的探索研究主要包括两种，即片层［1］和条带［2］. 本研究应用相同的生物支架材料，构建了两种形状的EHT，以探索形状对构建EHT的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料DMEM，胰酶，Matrigel基底膜基质，Hochest33258荧光染料，鬼笔鹅膏(美国Sigma公司)；胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)；生物素标记的羊抗小鼠试剂盒，DAB 显色试剂盒，免疫荧光标记的羊抗小鼠 IgG (中山试剂公司)；羊抗人肌钙蛋白 T（1∶100，福州迈新公司）；相差显微镜，激光共聚焦(Leica公司)；CO2培养箱(Forma公司)；铸模装置和单方向动态拉伸装置参照文献［3］的方法自制. 出生1～2 d的SD乳鼠（第四军医大学实验动物中心）.
　　1.2方法
　　1.2.1Ⅰ型胶原浓度的测定按照文献［4］的方法制备胶原溶液，胶原浓度为2.0 mg/mL.
　　1.2.2心肌细胞的分离无菌条件下取乳鼠心脏，PBS清洗，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 大小，用2.5 g/L的胰酶分解消化，吹打静置后取上清，入血清中终止消化，剩余组织重复操作至完全消化. 用200目筛网过滤收集液体，1000 r/min离心5 min，弃去上清，加入10 mL含100 mL/L血清的高糖 DMEM 培养液，于 50 mL/L CO2 37℃培养箱中培养 1 h (差速贴壁)，收集液体，离心弃上清后所得细胞为心肌细胞.
　　1.2.3EHT的制备液态 Ⅰ 型胶原与 2×DMEM 等比例混合，用 0.1 mol/L NaOH 调为中性，再加入100 g/L的Matrigel. 将终浓度为0.5×108 /mL的心肌细胞与上述混合物混合，加入方形槽中［5］和环形槽中［6］，混合物总量为1 mL，其中胶原1.0 mg，其它成分按比例换算. 置于50 mL/L CO2 37℃培养箱中，混合物凝固后，加含200 mL/L血清的高糖 DMEM 培养基. 1 d 后，可见心肌片层和心肌条带有明显的回缩，加入上述培养液，50 mL/L CO2 37℃培养箱中培养7 d. 共制备20个心肌片层，20个心肌条带.
　　1.2.4力学刺激EHT培养7 d后，套在动态拉伸装置的两平行金属圆杆上，调整间距，拉伸频率为 60/min，继续培养7 d.
　　1.2.5EHT的检测培养14 d后，进行以下各种检测，方法为: ① 肉眼及光镜观察片层和条带在培养期间跳动情况； ② HE染色片层和条带培养 14 d 后酒精固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜观察； ③ 免疫组织化学染色 样品经包埋，切片，脱蜡，复水，修复，1 mL/L TritonX100， 3 mL/L h3O2的甲醇溶液孵育 10 min，封闭血清作用 15 min，加羊抗人肌钙蛋白 T 抗体，4℃过夜. 加二抗，辣根标记的链霉卵白素作用15 min. DAB显色，透明，封片； ④ 鞣酸多彩（mason） 染色 EHT样本处理，切片脱蜡后，投入50 mL/L铵明矾液 12 min后水洗，再入 Regand 苏木素在室温下 5 min，950 mL/L酒精洗涤后，苦味酸酒精作用2 s后水洗，酸性品红作用5 min，蒸馏水冲洗后磷钼酸液分化，苯胺兰作用 5 min，蒸馏水洗后再用磷钼酸液分化 5 min，酒精脱水、二甲苯透明后封片； ⑤ 激光共聚焦检测 EHT经冰冻切片处理，抗原热修复，1 mL/L TritonX100，3 mL/L h3O2的甲醇溶液孵育 10 min，封闭血清作用15 min，加羊抗人肌钙蛋白T，4℃过夜. 避光加荧光标记的羊抗小鼠FITC，37℃孵育15 min，再加鬼笔鹅膏，室温15 min，加 Hochest33258荧光染料室温孵育 15 min，封片，用激光共聚焦显微镜观察并记录图象.
　　2结果
　　2.1肉眼及光镜观察构建的 EHT 培养1 d后出现明显的向心性回缩，镜下观察可见组织内部致密. 心肌片层在培养1 d可见点状自发性跳动，细胞排列杂乱；在第3 日时出现节律不一的局部跳动；在拉伸2 d后出现肉眼可见的一致性节律性跳动. 心肌条带在培养第 4 日时出现局部的节律性搏动；在拉伸后第 4 日形成肉眼可见的一致性跳动(图1).
　　A：培养1 d的心肌片层与心肌条带(箭头所示)；B：处于拉伸状态的心肌片层(箭头所示)；C：处于拉伸状态的心肌条带(箭头所示).
　　2.2HE染色观察HE染色结果显示，拉伸前EHT细胞排列零乱，拉伸后EHT多数心肌细胞沿同一方向伸展，纵向排列，胞核呈长梭形与天然成体心肌细胞相似(图2).
　　A：成年大鼠心肌组织×100；B：拉伸后心肌条带×200；C：拉伸后心肌片层×100
2.3免疫组织化学染色观察结果显示， EHT 细胞拉伸后内部的细胞均匀分布，沿拉伸方向伸展，胞核长梭形，细胞核完整，胞浆较丰富(图3).
　　A：正常心肌抗肌钙蛋白T×400；B：拉伸后心肌条带抗肌钙蛋白T×200；C：拉伸后心肌片层抗肌钙蛋白T×200.
　　图3抗肌钙蛋白T免疫组织化学染色结果

2.4mason染色结果显示，EHT细胞 内可见细胞间存在适量、均匀分布的蓝染的胶原，细胞质显示为红色，而细胞核为黑色(图4).
　　图4mason染色结果
　　2.5激光共聚焦检测在激光共聚焦显微镜下，可见构建的心肌片层内富含丰富肌丝的心肌细胞. 肌动蛋白显示红色，肌钙蛋白 T 显示绿色，细胞核显示蓝色，三者叠加后在蓝色细胞核的周围可见形成红绿相间的肌原纤维束(图5).
　　3讨论
　　采用有节律性收缩能力的EHT条带来移植并加固患者的心脏，有望提高患者心脏的泵血功能，特别适用于扩张型心脏病患者. 由于EHT片层可以根据实际的需要进行剪切，对于有房室缺损和心肌梗死患者替换和修补局限性的病灶较心肌条带会更有优势［7］. EHT多变的形状也更适用于临床需要. A: Hochest33258(兰色); B: 肌钙蛋白T阳性(绿色); C: 鬼笔鹅膏(红色); D: A， B，C组合后效果图.
　　本实验用溶解在酸性溶液里的鼠尾Ⅰ型胶原为支架材料［7］，添加Matrigel，并对其进行 1 wk 的动态力学刺激，mason 染色证明细胞间均匀地分布着适量的胶原，表明研究中加入的支架材料在细胞间存在并可发挥功能；HE 染色以及免疫组化显示细胞伸展充分排列整齐，大多数呈梭形，沿组织长轴排列；激光共聚焦显微镜下可见心肌片层内富含有丰富肌丝的心肌细胞. 这些结果均提示该方法能够成功构建出两种形状的，与正常成年大鼠心肌组织相类似的EHT.
　　在研究中我们发现，心肌片层出现自发性跳动的时间要明显早于心肌条带，与二维培养中细胞出现跳动的时间基本一致，说明片层较条带更有利于内部心肌细胞存活以及生理功能的发挥. 这可能是因为在相同体积时，片层的表面积远远要大于条带的表面积，而表面积与接触培养基的细胞量直接相关［8］. 在研究中我们还发现，心肌条带和心肌片层对构建EHT各有利弊. 构建心肌片层与心肌条带相比，对环境条件的要求相对低且构建成功率高. 这使得心肌片层在以后的应用中具有一定的优势. 但是，经力学拉伸后，在保持稳定性自发跳动和构建物形状和大小的维持方面，心肌条带要明显优于心肌片层. 心肌片层在去除力学刺激后，在相对短的时间里即可发生明显的回缩和跳动幅度的减弱. 事实上正常生理状态时，心腔是由三层心肌围绕而成的空腔，在血流的不断冲击下，心肌组织实际上也正是在一个环形的状态下不断的发育成熟和行使生理功能，这可能是环形为什么比片层在生理性和形状上都较为稳定的原因［9］.
　　目前，我们正试图通过提前进行动物体内移植来减缓心肌片层生理功能的这种变化，使心肌片层在移植后能够发挥最大的生理功能. 如何提高心肌条带的构建和移植的成功率是以后研究中需要解决的问题，还有待深入的研究与探讨.
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