关于子痫前期蜕膜组织差异蛋白的筛选与鉴定

　　　　　　　　 作者：冯亚玲，周昌菊，彭丽秀

【摘要】 　　目的： 应用蛋白质组学方法筛选子痫前期差异蛋白，探讨差异蛋白与子痫前期发生的可能关系. 方法： 收集５例正常足月妊娠妇女和５例足月子痫前期重度患者胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，提取总蛋白. 双向凝胶电泳技术对总蛋白进行分离，考马斯亮兰染色，获得蛋白质图谱. 用 PDQuest软件进行图像分析，寻找差异蛋白，随机选取8个差异蛋白质点进行胶内酶解，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）技术获得肽质量指纹谱，搜寻蛋白质数据库鉴定蛋白质并进行初步分析. 结果： 获得了正常妊娠及子痫前期重度患者蜕膜组织双向电泳凝胶图谱，蛋白质点子痫前期组为（436±13）个点，正常妊娠组为（425±16）个点，图像分析结果显示表达丰度相差2倍以上的差异蛋白质点有14 个，它们在子痫前期中均表现下调. 随机选取的8个蛋白质点均成功得到鉴定，它们分别是膜联蛋白Ⅴ，血红蛋白β链，RhoGDP解离抑制剂1，氯离子细胞内通道蛋白1，原肌球蛋白4，平滑肌蛋白22α2，α1抗胰蛋白酶和纤维蛋白原β链. 结论： 子痫前期重度患者蜕膜组织中存在差异蛋白，这些蛋白质在子痫前期的发病过程可能起重要作用.
【关键词】 先兆子痫；蜕膜；蛋白质组学；电泳，凝胶，双向
　　【Abstract】　AIM: To screen the differential proteins in deciduas of preeclampsia and to study their roles in preeclampsia. METHODS: The deciduas from 5 normal women of fullterm pregnancy and 5 preeclampsia patients were collected to obtain the total proteins.The proteins from the 2 groups underwent twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) and Coomassie brilliant blue stained gel imaging with PDQuest image analysis software. The peptide mass fingerprinting(PMF) was acquired by matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) .The resulted data were then searched against protein databases for the identification of the proteins， and an initial analysis was made accordingly. RESULTS: 2DE patterns of the deciduas of normal fullterm pregnancy group and preeclampsia group were acquired.According to them， (436±13) protein spots were seen in preeclampsia group and( 425±16) in normal pregnancy group.Fourteen differential spots were downregulated in preeclampsia group among them and 8 differential spots were all successfully identified.They were Annexin Ⅴ， Hemoglobin β chain， RhoGDPdissociation inhibitor 1， chloride intracellular channel protein 1，Tropomyosin α4 chain， Transgelin 22α2， α1antitrypsin and Fibrinogen β chain， respectively. CONCLUSION: Differential proteins found in deciduas from patients with severe preeclampsia might play an important role in the pathogenic process of preeclampsia.
　　【Keywords】 preeclampsia; decidua; proteomics; electrophoresis， gel， twodimensional
　　0引言
　　　子痫前期（preeclampsia，PE）是一种人类妊娠期间特有的原因不明的多系统疾病，严重危害母婴健康［1］. 蛋白质组学是近年来兴起的一门新学科，因具有高通量的特点而广泛应用于临床. 子痫前期的蛋白质组学研究主要集中在寻找早期特异性蛋白质标志物和发病机制的探讨［2-3］，并运用蛋白质组学技术对子痫前期患者的外周血、脑脊液、羊水和胎盘滋养细胞等进行了各种研究［4］. 但目前子痫前期仍然没有理想的标志物，具体的发病机制仍未阐明. 本实验利用蛋白质组学技术，通过比较子痫前期重度患者和正常妊娠妇女蜕膜的蛋白表达差异，探讨引起子痫前期发生的可能因素，为研究子痫前期的病因和寻找特异性标志蛋白提供依据.
　　1对象和方法
　　1．1对象选择 200609/200704在中南大学湘雅第三附属医院产科住院的足月子痫前期重度患者５例（ 诊断及分类参照全国统编教材《妇产科学》第 ６ 版）为子痫前期组；正常足月妊娠患者５例（无内外科合并症，因臀位和头盆不称）为正常妊娠组. 子痫前期组与正常妊娠组年龄分别为23～34（30.56±3.26）岁和24～31（27.22±2.89）岁，差异无统计学意义（P＞0.05）；分娩孕周分别为35+6～39+2（37.86±2.02） wk和37+2～39+6（38.35±1.89） wk，差异无统计学意义（P＞0.05）. 两组患者分娩方式均为硬膜外麻醉下剖宫产. 在胎盘娩出后即刮取胎盘母面及宫壁上的蜕膜组织，用冰无菌生理盐水冲洗，去除血液及黏液成份并吸干水份，取新鲜蜕膜组织5 g，液氮保存备用. 另取部分蜕膜组织用40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋备HE染色用. 术前静脉抽血3 mL，3000 r/min，离心15 min，取上清液保存备用.
　　丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠（SDS），四甲基乙二胺（TEMED），过硫酸铵（AP），丙基硫酸盐，三羟甲基氨基甲烷等（美国SigmaAldrich 公司）；胰蛋白酶（美国 Promega 公司）；低温高速离心机（Hettich公司，16R型）；VoyayerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪（Applied Biosystem 公司）；固相pH胶条（pH 3～10，24 cm），2D Quant Kit蛋白定量试剂盒和双向电泳系统（IPGphor等电聚焦仪，Ettan DALT垂直电泳槽，Imagescanner 图像扫描仪，图像分析软件 PDQuest）为瑞典Amersham Biosciences公司产品.
　　1．2方法
　　1.2.1蛋白样品的制备收取的冻存蜕膜组织，经过裂解液裂解、研磨、离心取上清液提取蜕膜组织总蛋白，分装，-70℃保存. 按2D Quant Kit蛋白定量试剂盒操作步骤测蛋白质浓度.
　　1.2.2双向凝胶电泳第一向固向IPG胶条等电聚焦 ，1000 μg总蛋白质与水化上样缓冲液混合，总体积 450 μL，加入IPG胶槽中，24 cm IPG固向胶条，线性，pH 3～10，IPG phor水平电泳仪电泳. 等点聚焦条件设置： ① 30 V，20℃水化 14 h； ② 500 V/h； ③ 快速升压 1000 V/h， 除盐； ④ 线性升压 8000 V/8.5 h等电聚焦. 胶条在平衡液A液与B液各平衡15 min后胶条移至分离胶上进行第二向电泳即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳条件如下：恒压，2.5 w/胶，30 min，然后以11 w/胶恒功率电泳， 直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底边停止电泳. 第二向电泳时间约需6 h左右.
　　1.2.3考马斯亮蓝染色取出电泳后的凝胶，双蒸水清洗后用考马斯亮蓝G250的染色方法进行显色. 染色固定过夜，双蒸水清洗脱色直至背景清晰.
　　1.2.4图像采集与分析考马斯亮蓝染色后的凝胶通过ImageScanner扫描仪以及LabScan扫描仪控制软件进行图像扫描以获取二维凝胶的电子图像. 运用图像分析软件PDQuest 7.0进行分析， 包括蛋白质点的检测，背景消减，标准化，匹配，建立平均凝胶，比较差异等分析以确立差异表达的蛋白质.
　　1.2.5蛋白质酶解经过图像分析，随机选取丰度差异表达相差2倍以上的14个点中的8个点做质谱鉴定. 用人工方法切胶，洗胶，脱色，脱水，原位酶解. 然后进行样品萃取，点样.
　　1.2.6MALDITOFMS质谱分析将制备好的点样板放入VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS质谱仪中进行分析，获得肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）.
　　1.2.7数据库查询MALDITOFMS质谱图解谱采Mascot Wizard软件进行 ，Mascot Wizard软件均采用其默认参数设置. 其查询网址为：www.matrixscience.com/cgi/searchform.pl?FORMVER=2＆SEARCH=PMF. 在NCBInr，Swissprot蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白，结合蛋白质在胶上的等电点和分子量鉴定蛋白质. Mascot分数＞55分则认为得到鉴定，否则视为未得到鉴定.
　　统计学处理： 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，进行t检验，以α=0.05（双尾）为检验水准，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2．1蜕膜组织的HE染色经HE染色证实，实验所取子痫前期组与正常妊娠组胎盘母面组织均为蜕膜组织. 大部分典型多边形蜕膜细胞，呈铺砖状排列，未见绒毛（图1）.
　　图1蜕膜组织HE ×400
　　2．2蜕膜组织总蛋白质双向电泳图谱 两组蜕膜组织总蛋白在相同条件下进行双向凝胶电泳分离，并重复3次. 图像扫描后，得到重复性好的两组蜕膜组织的双向电泳图谱 （ 图 2）. 子痫前期组图谱检测到（ 436±13）个点， 平均匹配率为79.2%. 正常妊娠组图谱检测到（425±16）个点，平均匹配率为78.6%. 蛋白点主要集中在Mr = 13～80 ku，pH=3～8范围.

A：正常妊娠组蜕膜组织； B：子痫前期组蜕膜组织.
　　图2蜕膜组织考马斯亮蓝染色图谱
　　2.3差异蛋白质点的质谱鉴定PDQuest 软件进行图像分析发现，选取丰度差异表达相差2倍以上的蛋白质点有14个，在子痫前期组表达均下调. 随机选择8个差异表达的蛋白质斑点均成功得到鉴定. 图3为子痫前期组和正常妊娠组部分显著差异蛋白点的局部放大图. 黑箭头所指为已鉴定的部分显著差异蛋白质点，其数字代表相应的蛋白质点号. 用Mascot软件搜索蛋白数据库，获得对应的蛋白质(表1).
　　A：正常妊娠组蜕膜组织；B：子痫前期组蜕膜组织.
　　图3蜕膜组织部分显著差异蛋白点的局部放大图
　　3讨论
　　　人体蜕膜组织是母胎界面的重要组成部分，与胎儿滋养层直接接触，具有参与母胎免疫耐受形成及维持妊娠的功能. 在吕英璞等［5］的研究中发现子痫前表1蛋白质点肽质量指纹图谱检索SWISSPROT数据库结果期患者蜕膜组织中Th1/Th3比率明显高于外周血，母胎界面的局部免疫失调，尤其是Th1细胞的过度表达是子痫前期发病的关键环节之一. 本研究选取分娩后的蜕膜组织，能够直接反应该疾病母胎界面存在的蛋白分子变化.
　　在本研究中，膜联蛋白Ⅴ在子痫前期组中表达明显下调. 膜联蛋白Ⅴ是一种胎盘内抗凝蛋白，对暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性. 在体内，磷脂酰丝氨酸存在于活化血小板或活化内皮细胞的质膜外层，为凝血因子提供一个聚集进而促发凝集的表面. Tait 等［6］在兔和猪血栓模型中都发现了膜联蛋白Ⅴ的抗凝作用具有血小板指引靶向性. 膜联蛋白Ⅴ这种抗凝蛋白不足很可能是造成子痫前期患者的高凝状态的原因之一. α1抗胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可通过对各种蛋白酶的抑制作用，保护组织免受蛋白酶破坏，从而维持机体内环境稳定. 凝血酶也是一种以丝氨酸为活动中心的蛋白酶. 本研究中发现α1抗胰蛋白酶在子痫前期组中表达下调. 由此我们推测由于α1抗胰蛋白酶这种凝血酶抑制剂分泌不足导致凝血酶增高从而参与了子痫前期患者高凝状态的发生发展. RhoA属于Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，是重要的细胞内信号分子. 它能结合并水解鸟苷酸，结合GTP为活性型，结合GDP为失活型. 有研究［7］表明RhoA可能通过调节滋养细胞浸润、低氧反应及血管舒缩功能等参了与子痫前期的发病. 本研究发现RhoGDP解离抑制剂1在子痫前期中表达下调，相应解离的RhoA将增加，活性RhoA就应在子痫前期中高表达，这与其他研究结果理论上是一致的. 纤维蛋白原β链是由肝合成和分泌的一种糖蛋白，其转录被认为是整个纤维蛋白原分子表达的限速步骤， FgBβ基因多态性单独或与环境因素作用使循环中的血浆纤维蛋白原水平升高，在调节血浆纤维蛋白原水平方面起重要作用［8］ . 本研究结果显示这些蛋白在子痫前期组表达均下调，它们在子痫前期中的作用以及本实验中的2DE图谱蛋白质点并不是很多，如对样品采用预分级和亚蛋白质组重叠技术有助于低丰度等功能蛋白的检出等问题还有待我们进一步探讨.
【参考文献】
［1］Koy C， Heitner JC， Woisch R， et al. Cryodetector mass spectrometry profiling of plasma samples for HELLP diagnosis: An exploratory study［J］. Proteomics， 2005，5(12):3079-3087.

［2］Norwitz ER， Tsen LC， Park JS， et al. Discriminatoryproteomic biomarker analysis identifies free hemoglobin in the cerebrospinal fluid of women with severe preeclampsia［J］. Am J Obstet Gynecol， 2005，193(3)957-964.

［3］Vascotto C， Salzano AM， DAmbrosio C， et al. Oxidized transthyretin in amniotic fluid as an early marker of preeclampsia［J］. Clin Chem，2007，6(1):160-170.

［4］Sun LZ， Yang NN， De W， et al. Proteomic analysis of proteins differentially expressed in preeclamptic trophoblasts［J］. Gynecol Obstet Invest， 2007，64(1):17-23.

［5］吕英璞，张文真，卢小燕，等. 辅助性T淋巴细胞1和2比率变化与妊娠期高血压疾病发病的关系［J］. 中华妇产科杂志，2006，2 (41):103-107.

［6］Tait J F， Cerqueira MD， Dewhurst TA， et al. Evaluation of annexin Ⅴas a plateletdirected thrombus targeting agent［J］ . Thromb Res ，1994，75:491-501.

［7］周丽，乔福元. RhoA在子痫前期患者胎盘中的表达［J］. 现代妇产科进展，2006，15(12):925-927.

［8］张焕铃，刘瑛，王俊霞，等. 纤维蛋白原Bβ148C/T基因多态性［J］. 第四军医大学学报，2005，26(19):1772.