关于骨巨细胞瘤组织中VEGF和MMP 2表达及意义

【摘要】 目的： 研究VEGF和MMP2在骨巨细胞瘤(GCT)组织中的表达情况及其与GCT血管生成和增殖状态的关系，并分析各种因素在GCT预后中的作用. 方法： 采用SP法检测85例患者标本VEGF， MMP2， PCNA， CD34表达，分析其与GCT转移、复发的关系，并采用Cox回归模型分析GCT复发的影响因素. 结果： 85例GCT患者中VEGF，MMP2的阳性表达率分别为62.4%和56.5%，增殖指数(PI)值为(52.0±21.5)%，微血管密度(MVD)值为(33.4±9.6)条. 不同VEGF表达组间PI均值，MVD均值差异有统计学意义(P&<0.01). 不同MMP2表达组间MVD均值差异有统计学意义(P&<0.01). 不同VEGF表达组，不同MMP2表达组比较，其转移率、复发率差异有统计学意义(P&<0.01). MVD值在有无转移组、有无复发组之间差异有统计学意义(P&<0.01). PI值有无复发组之间差异有统计学意义(P&<0.05). 多因素Cox回归分析显示，VEGF(RR=6.056)， MMP2(RR=5.387)， MVD(RR=3.121)是影响GCT复发的危险因素；与常规刮除术相比，广泛完整切除术(RR=0.176)是影响GCT复发的保护因素. 结论： VEGF， MMP2表达与骨巨细胞瘤的血管生成、细胞增殖及复发有关，可作为判定骨巨细胞瘤预后的参考指标.
【关键词】 巨细胞瘤 骨 内皮生长因子 基质金属蛋白酶类 免疫组织化学
　　0引言
　　骨巨细胞瘤(GCT)是一种具侵袭性、潜在恶性的骨肿瘤，复发率较高，其发病率在我国远高于欧美国家. GCT因其细胞成分复杂， 生物学行为多变，导致Jaffe的组织病理学分级、Campanacci的X线分度以及Enneking的外科分期均不能很好地反映其生物学行为. 近年来，国内外很多学者通过检测肿瘤组织中特定基因和蛋白产物表达，力求找寻可靠而有效的指标来预测肿瘤的复发，指导临床治疗［1］. 我们应用免疫组化技术检测人骨巨细胞瘤中血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达，探讨其与肿瘤微血管密度(MVD)、增殖指数(PI) 的关系，及其对人骨巨细胞瘤转移、复发的影响. 1对象和方法
　　1.1对象我院骨外科1995/2006年接受手术切除的GCT患者85（男48，女37）例；年龄20~54(平均33) 岁. 随访时间为13~108(平均40.1) mo. 复发组30例，无复发组55例；转移组11例，无转移组74例.
　　1.2方法肿瘤组织用40 g/L的甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，采用SP法进行免疫组化染色. 鼠抗人VEGF， MMP2，增殖细胞核抗原(PCNA)及CD34 mAb，SP试剂盒均为Santa Cruz公司提供. 染色步骤按照说明书进行. 以磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照. 以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为VEGF阳性细胞，以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒判为MMP2阳性细胞， 参照文献［2］的方法，计数肿瘤细胞阳性细胞数并结合染色强度进行染色结果评分. ① 染色强度评分：阴性为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分；② 阳性细胞百分数评分：0%的阳性细胞数为0分，&<25%的阳性细胞数为1分，25%～50%的阳性细胞数为2分，&>50%的阳性细胞数为3分. ①+②为最终评分: 总分0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为()，&>6分为(). PCNA 阳性细胞为核着色，计数1000个细胞中PCNA阳性细胞数，以PI值表示肿瘤细胞增殖情况：PI=(阳性细胞数/1000)×100%. 另CD34阳性判断以细胞质和胞膜出现棕褐色颗粒为阳性. 按文献［2］的方法进行MVD记数.
　　统计学处理:采用SPSS13.0进行，计量资料两组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，预后分析采用Cox回归. P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1VEGF和MMP2在骨巨细胞中的表达85例骨巨细胞瘤中VEGF和MMP2的阳性表达率分别为62.35%和56.47%. VEGF呈胞质着色，以多核巨细胞多见，强阳性染色的瘤细胞多位于浸润边缘或细胞活跃增生区；MMP2呈胞质着色，多核巨细胞及单核基质细胞均有表达. 85例病例均有PCNA表达，PI值为(52.0±21.5)%. CD34主要表达于血管内皮细胞，全部病例的MVD值为(33.4±9.6)条.
　　2.2VEGF， MMP2与PI， MVD关系VEGF阳性组与阴性组间PI均值、MVD均值差异有统计学意义(t=2.817， P=0.006；t=5.824， P=0.000). MMP2阳性组与阴性组间MVD均值差异有统计学意义(t=4.962， P=0.000)，而两组PI均值差异无统计学意义(P&>0.05，表1). 表1VEGF， MMP2与PI， MVD关系
　　2.3VEGF， MMP2， PI和MVD与骨巨细胞瘤转移、复发的关系VEGF阳性组与阴性组比较，MMP2阳性组与阴性组比较，其转移率、复发率差异均有统计学意义(χ2=7.629， P=0.006；χ2=8.694， P=0.003；χ2=9.740， P=0.002；χ2=7.693， P=0.006). MVD值在转移组与无转移组、复发组与无复发组之间差异均有统计学意义(t=2.356， P=0.021；t=5.867， P=0.000). PI值在复发组与无复发组间差异有统计学(t=4.458， P=0.000)，而在转移组与无转移组间差异无统计学意义(P&>0.05，表2).表2VEGF， MMP2，PI和MVD与骨巨细胞瘤转移、复发的关系
　　2.4骨巨细胞肿瘤复发影响因素Cox回归分析我们将可能影响GCT预后的13种因素(性别、年龄、病程、发病部位、肿瘤体积、病理性骨折、骨皮质破坏或软组织浸润、动脉瘤样骨囊肿形成、手术方式、VEGF、MMP2、PI和MVD值)进行Cox回归分析. 首先进行单因素Cox回归分析，结果表明性别、病程、手术方式、VEGF、MMP2、PI和MVD值对复发均有影响. 进一步多因素Cox回归分析显示，VEGF、MMP2、MVD和手术方式对复发有明显影响. 其中VEGF(RR=6.056)，MMP2(RR=5.387)，MVD(RR=3.121)是影响GCT复发的危险因素；与常规刮除术相比，广泛完整切除(RR=0.176)是影响GCT复发的保护因素(表3). 3讨论
　　肿瘤细胞浸润和转移是一个复杂的过程，其中肿瘤新生血管的形成和细胞外基质的降解起着较为关表3骨巨细胞肿瘤复发多因素Cox回归分析结果键的作用. 血管内皮生长因子(VEGF)可以促进血管内皮细胞分裂和增值、增加微血管通透性，诱导内皮细胞合成蛋白水解酶，这不仅有利于血管的生成，而且有利于肿瘤细胞脱落后进入血管或邻近结缔组织并进一步扩散. MMP2作为金属基质蛋白酶家族的重要成员，是降解Ⅳ型胶原之一. 肿瘤细胞通过分泌MMP2，降解肿瘤细胞周围的细胞外基质和基底膜，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，对肿瘤的侵袭、转移产生重要影响，同时肿瘤细胞分泌的MMP2可以降解毛细血管内皮层下基底膜和细胞外基质，使内皮细胞向外迁移并增殖，最终形成新的血管和基底膜. 已有研究证明，VEGF，MMP2在多种恶性肿瘤中高表达，且其表达水平与恶性肿瘤的增殖、转移和复发相关［3-4］.
　　骨巨细胞瘤中VEGF， MMP2呈高表达，且VEGF阳性表达的MVD值，PI值显著高于阴性表达，提示VEGF可以促进GCT新血管形成和GCT细胞增值. VEGF，MMP2在转移患者中阳性表达率较高，其机制可能为：VEGF的促血管生成作用导致肿瘤血管数目和血管表面积的增加，从而提高了肿瘤细胞从瘤体侵入血循环的可能性；VEGF还可诱导内皮细胞表达纤溶酶原激活剂及其抑制因子、组织间隙胶原酶等活性物质，从而改变内皮细胞的形状并降解基膜中的IV型胶原，导致邻近细胞间出现裂隙，血管通透性增加，肿瘤细胞更容易从血管扩散. 表达VEGF特异性受体flt1的血管平滑肌细胞在受到VEGF刺激后，MMP2的表达量呈明显升高趋势. MMP2可降解GCT中血管基膜的主要成分，从而促进肿瘤细胞向正常组织侵袭和侵入血循环［5］. 研究还发现，转移患者、复发患者MVD值显著增高，肿瘤组织内的血管分支变细，血流变得缓慢，在血管通透性较高的肿瘤边缘血管，减慢的血流为血浆内纤维蛋白等成分渗出至肿瘤间质提供了便利，而基质成分的增加又促进肿瘤的生长和侵润. 多因素Cox回归分析表明，随着VEGF和MMP2表达升高和MVD值的增加，GCT复发的风险增大. VEGF，MMP2，MVD作为GCT的独立危险因素，对于GCT的预后具有较高的预测能力. 与常规刮除术相比，广泛完整切除具有保护作用. 对于GCT患者而言，刮除术复发率为27%，边缘切除术复发率为8%，广泛切除术或根治术复发率为0. 然而广泛切除术或截肢术会给患者造成肢体功能障碍甚至心理疾病［6］. 因此，寻找更有效的治疗方式，既可预测GCT的预后又能保护患者肢体功能，是我们今后努力的方向.

参考文献

［1］朱振生，武文，金合. 骨巨细胞瘤中生物大分子表达及其意义研究进展［J］. 肿瘤研究与临床，2005，17:51-54.

［2］叶恒志，张其亮，扬树华. 骨巨细胞瘤MMP9、血管内皮生长因子表达及其意义［J］. 肿瘤学杂志，2004，10(5):320-322.

［3］ Oka N， Soeda A， Inagaki A， et al. VEGF promotes tumorigenesis and angiogenesis of human glioblastoma stem cells［J］. Biochem Biophys Res Comm， 2007，360(3):553-559.

［4］ Rajapakse N， Mendis E. Sulfated glucosamine inhibits MMP2 and MMP9 expressions in human fibrosarcoma cells［J］. Bioorg Med Chem， 2007， 15(14):4891-4896.

［5］ 潘昆，陈峥嵘. 骨巨细胞瘤中血管内皮生长因子及微血管密度的表达［J］. 复旦学报，2003， 30(3):239-242.

［6］ 杨宣涛，张贤良，步宏，等. 血管内皮生长因子受体在骨巨细胞瘤中的表达及其与肿瘤增殖和血管生成关系的研究［J］. 中国骨肿瘤骨病，2003，2(1):23-32.