关于双歧杆菌在短肽肠内营养液中的存活力

【摘要】 目的： 研究双岐杆菌在短肽肠内营养液中的存活力. 方法： 将50 g/L两歧双歧杆菌菌悬液加入120 g/L短肽营养液中，37℃厌氧培养箱中培养，分别在0， 4， 8， 12， 14， 16， 20， 24 h时间点取样进行活菌数、A550、酸度和pH测定. 结果： 在短肽肠内营养液中接种两歧双歧杆菌后，活菌数在培养0～16 h生长速度较快，16 h达最高峰，以后下降. A550随着时间的延长而增加. 酸度也随着培养时间的延长而增加，在培养0～14 h之间增加较快，14 h以后增加缓慢. pH值随培养时间的延长而下降，在培养0～12 h之间下降较快，12 h以后下降缓慢. 结论： 双歧杆菌能在120 g/L的短肽肠内营养液中较好地存活，且在12~14 h期间应停止发酵.
【关键词】 二裂菌属 肠道营养 短肽 存活力
　　0引言
　　临床上有许多危重患者，在应激状态下可出现一系列代谢改变，这种代谢紊乱贯穿于危重病的始终，可引起肠黏膜损害和营养素、维生素B12、脂溶性维生素的吸收障碍，导致患者出现一系列营养问题［1］，肠内营养支持可激活肠道神经内分泌系统，促进胃肠黏膜生长，保持肠道及机体免疫系统正常，维护肠黏膜屏障功能，改善机体的营养不良［2］. 然而，有部分患者因抗生素、激素和化疗药物的应用导致菌群失调，在肠内营养支持的过程中，出现腹泻，影响了营养治疗效果［3］. 双歧杆菌是肠道有益菌的主体，是肠道生物屏障的重要组成部分，可纠正微生态失衡，防治肠源性感染［4］. 我们观察双歧杆菌在短肽肠内营养液中存活情况，为研究益生菌肠内营养制剂提供科学依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料两歧双歧杆菌和双歧杆菌培养基从甘肃省科学院生物所购得. 牛奶培养基：将超市购买来的完达山脱脂奶粉配制成120 g/L的浓度，分装于试管中，每支10 mL，塞上硅胶塞，置于高压蒸汽灭菌器中，于121℃下灭菌10 min，切断电源，缓慢排气，冷却后置于冰箱冷藏柜中备用. 短肽型肠内营养剂（粉剂）百普素购自荷兰纽迪希亚有限公司， 主要成分为水解乳清蛋白、麦芽糖糊精、植物油、矿物质、维生素、微量元素， 为淡黄色细粉，略有芳香气，味微苦涩. 在无菌操作条件下配制成120 g/L的浓度，分装于试管中，每只10 mL，塞上硅胶塞. 现用现配，为避免营养素破坏，配制好的营养液不能高压蒸汽消毒，采用过滤除菌法. 仪器：YQX－Ⅱ厌氧培养箱，净化工作台，2D2A型自动电位滴定仪，6230M酸度计，725 s可见分光光度计，立式电热压力蒸汽灭菌器，电热恒温水浴箱，电子天平，Olympus显微镜，电热恒温干燥箱.
　　1.2方法为保证菌种的活力，每月活化1次. 方法是在无菌条件下，按1∶9的比例将镜检无杂菌的菌悬液加入双歧杆菌培养基中， 37℃厌氧培养48 h. 按50 g/L的接种量将活化后的菌悬液加入120 g/L百普素的营养液中，37℃厌氧培养24 h. 对上述双歧杆菌营养液进行色、味、凝固性以及酸甜比例等感官评定. 在无菌操作条件下，将菌悬液0.5 mL加入牛奶培养基4.5 mL中， 37℃厌氧培养，观察牛奶培养基凝固时间. 对37℃厌氧培养的双歧杆菌营养液，按0， 4， 8， 12， 14， 16， 20， 24 h时间点取样进行活菌数、A550值、酸度和pH测定. 在培养过程中定时取样0.5 mL于4.5 mL无菌生理盐水的试管中，进行10倍梯度稀释，选择适当的稀释度，吸取0.2 mL到琼脂培养基平板中，涂布均匀，置于37℃厌氧培养48 h，进行菌落计数，并革兰染色观察菌落特征和细菌形态. 在无菌操作条件下，定时取样0.5 mL，适当稀释，采用比浊法测定A550值，所测A550值乘以稀释倍数即为实际A550值. 在无菌条件下取出营养液10 mL于50 mL小烧杯中，加入蒸馏水20 mL，混匀，用校正过的酸度计进行测定.
　　2结果
　　百普素溶液在加入双歧杆菌后仍呈淡黄色，气味芳香，在原有苦涩味的基础上，略有酸味，不凝固. 菌落为圆形，半透明，光亮，突起，全缘，质地较软，针尖般大小. 在镜下可见革兰氏染色阳性的多形态杆菌，呈Y，V字形，变曲状、刮勺状，其典型的形态是分叉的杆菌，未见其他杂菌（图1）. 接种在百普素中的菌悬液凝乳时间为272 min. 双歧杆菌在短肽营养液中活菌数在培养0～16 h之间呈上升趋势，且0～16 h生长速度较快，16 h活菌含量达到最高峰. A550随培养时间的延长而增加，在培养0～16 h之间，A550增加较快，16 h以后增加缓慢（图2）. 酸度随培养时间的延长而增加，在培养0～20 h呈上升趋势，20 h达高峰，20 h后开始缓慢下降. pH值随培养时间的延长而下降，在培养0～12 h之间，pH值下降较快，12 h以后下降缓慢（图3）. 3讨论
　　在短肽型肠内营养制剂百普素营养液中接种两歧双歧杆菌后，感官性状未发生明显变化，双歧杆菌的形态和菌落形成都比较正常，没有使百普素凝固. 凝乳时间与制酸奶的凝乳时间基本相同，表明双歧杆菌在百普素营养液中能够存活. 百普素中含有人体需要的各种营养物质，尤其是含有水解乳清蛋白、维生素B1，B2，B6，C，尼克酸，泛酸和叶酸以及盐类，双歧杆菌之所以能在其中生长，可能与此有关. 益生菌制品在饮用之前，其益生菌含量必须达到1×109 cfu/L以上才能达到保健功效，而新鲜的益生菌制品活菌数要求不得低于1×1010 cfu/L才能补偿益生菌在通过人体胃肠道时活菌数的损失［5］. 我们发现，双歧杆菌在百普素营养液中培养24 h A550值一直处于上升趋势，且16 h时活菌数达到7.94×1012 cfu/L，达到了益生菌含量的要求.
　　百普素属于中性要素饮食，其pH是双歧杆菌存活的重要条件之一. 双歧杆菌不耐酸，在pH在5.0以下生长缓慢［6］. 我们发现，双歧杆菌在培养过程中，细菌总数一直在增加，活菌数在0～16 h之间繁殖较快，16 h后活菌数下降. 营养液中的酸度也随着时间的延长而增加，20 h后酸度下降. pH随着时间的延长而下降，12 h后下降缓慢，可能是由于双歧杆菌对糖的分解而产生大量的醋酸、乳酸和其他有机酸所致. 尽管在16 h时营养液中活菌数最多，但此时pH已下降到了4.87，不利于双歧杆菌的进一步的存活和繁殖，16 h后活菌数下降，在12～14 h时pH值在5.0以上，而此期间活菌含量大于1×1011 cfu/L数量级，能起到保健功能. 临床要求配制好的营养液给患者使用时，营养液要新鲜，不得超过24 h［7］. 因此接种了双歧杆菌的百普素营养液在培养12～14 h时可停止发酵且在24 h之前使用. 另外，双歧杆菌不耐酸和胆盐，仅适用于鼻空肠和空肠造口患者的肠内营养支持.

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参考文献

】
［1］ 黄海涛. 肠内营养研究进展［J］. 广西医科大学学报， 2005， 22(1):147-149.

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［4］ Schneider SM， GirardPipau F， Filippi J， et al. Effects of Saccharomyces boulardii on fecal shortchain fatty acids and microflora in patients on longterm total enteral nutrition［J］. World J Gastroenterol， 2005， 11(39):6165-6169.

［5］ Sanders ME. Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health ［J］. J Nutr， 2000， 130(2Suppl):384S-390S.

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［7］ 程燕玲，刘娜，刘亚光. 一次性无菌灌肠器在空肠造瘘营养液灌注中的应用［J］. 西北国防医学杂志， 2007， 28(2):157.转贴于