900 MHz电磁辐射对淋巴细胞作用的显微激光共焦拉曼光谱分析

　　　　　　　　作者：康立丽，黄耀熊，罗曼，余晓锷，袁志坚

【摘要】 　　目的： 探讨900 MHz电磁波对淋巴细胞的影响. 方法： 利用显微激光共焦拉曼光谱技术获得功率密度为5 mW/cm2的900 MHz电磁波照射不同时间的淋巴细胞的拉曼光谱. 结果： 照射20 min后，部分淋巴细胞拉曼光谱出现了微小变化；照射40 min后，包含类胡萝卜素信息的细胞核拉曼光谱出现明显变化，细胞核的拉曼光谱的一些谱带也发生了变化；照射60 min后，淋巴细胞拉曼光谱位于787 cm-1的谱线移动了8 cm-1，显示细胞核受到电磁辐射后产生明显的损伤. 结论： 长时间处于5 mW/cm2电磁波作用下（≥40 min），淋巴细胞出现损伤，损伤主要表现在蛋白构象变化和DNA的碱基受到损伤，从而影响其功能.
【关键词】 900 MHz电磁波辐射；淋巴细胞；光谱分析，拉曼
　　【Abstract】 AIM: To study the effect of 900 MHz electromagnetic fields on the lymphocytes at molecular level. METHODS: The lymphocytes exposed to 900 MHz electromagnetic fields with power density of 5 mW/cm2 were measured by confocal Raman microspectroscopy technique. RESULTS: After 20 min exposure， Raman spectra of some lymphocytes changed a little. After 40 min， obvious difference appeared in the Raman spectra of the nucleolus either with the information of carotenoids or without. After 60 min exposure， the Raman band at 787 cm-1 shifted 8 cm-1， indicating that there was obvious damage in the lymphocytes. CONCLUSION: The exposure of lymphocytes to 900 MHz electromagnetic fields of 5 mW/cm2 for a period of time (≥40 min) would induce damage in lymphocytes， including the change of protein structure and the damage of DNA base conformation， which suggests that the function of lymphocytes would be affected by the electromagnetic fields.
　　【Keywords】 900 MHz electromagnetic radiation; lymphocytes; spectrum analysis， raman
　　0引言
　　电子技术的飞速发展和通讯技术的普及使得电磁辐射越来越为人们关注. 一定强度的电磁辐射可影响细胞膜、细胞内蛋白及DNA的结构和功能. 淋巴细胞是人体具有特异免疫功能的白细胞. 淋巴细胞可能在大功率电磁辐射作用下出现损伤，从而影响免疫应答等功能及致使染色体畸变率增加［1-3］. 本文利用功率密度为5 mW/cm2（相当于中继站的功率密度水平）的900 MHz电磁辐射作用淋巴细胞，测定不同作用时间下单个淋巴细胞的拉曼光谱，以求在分子水平对其作用情况进行研究分析.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　使用Horiba JY公司生产的倒置显微激光共焦拉曼散射仪LabRam INV，配备514 nm Ar+离子激光器和奥林巴斯倒置显微镜（60倍物镜）. 激光焦点为1~2 μm，狭缝尺寸100 μm，波谱范围600~1800 cm-1，谱分辨率1 cm-1左右，曝光积分时间10 s. 电磁辐射源为深圳市威特信科技有限公司生产的VTXJ0408A信号屏蔽器，样品辐照功率为5 mW/cm2.
　　1.2方法
　　1.2.1淋巴细胞制备
　　健康志愿者提供静脉血1 mL，利用9 mL/L生理盐水稀释至2 mL. 取1 mL稀释血液移入等量淋巴分离液上层，1000 r/min离心20 min. 分离出中间部分的淋巴细胞，并用等渗PBS洗涤2次（2000 r/min，5 min）. 将分离后的淋巴细胞放置在温度为37℃的CO2培养箱内备用.
　　1.2.2样品测量
　　在37℃的CO2培养箱内放置30 min后取出部分淋巴细胞进行拉曼测试(对照组)，同时将部分淋巴细胞放置在5 mW/cm2的连续电磁辐射环境下进行辐射，作用时间分别为20， 40和60 min.每组样品选取10~12个淋巴细胞进行测试.对准细胞中央进行扫描，获取淋巴细胞的拉曼光谱，并对获取的拉曼光谱进行归类分析.正常情况下，淋巴细胞的细胞核占据了细胞的大部分区域，因此对准细胞中央扫描获得的应是淋巴细胞细胞核拉曼光谱.
　　2结果
　　辐射功率为5 mW/cm2的900 MHz电磁辐射辐照淋巴细胞20 min后，多数淋巴细胞的拉曼光谱与未照射的淋巴细胞的拉曼光谱没有显著性差别，谱线位置与谱线强度基本一致. 但部分淋巴细胞开始出现一些变化（图1A）. 位于1620 cm-1附近的谱线有轻微下降，位于1520 cm-1位置的谱线强度轻微下降. 位于850 cm-1附近的谱线（隶属于酪氨酸）在照射20 min后强度相对增加，但是I850/I830仍小于1.
　　电磁辐射作用淋巴细胞40 min后，淋巴细胞的拉曼光谱与未经电磁辐射照射的淋巴细胞的拉曼光谱在一些谱带上可见差异（图1B，D）. 图1B对应细胞核的拉曼光谱；图1D对应包含类胡萝卜素信息的细胞核拉曼光谱. 辐照20 min的淋巴细胞也有包含类胡萝卜素信息的拉曼光谱，其与对照组的拉曼光谱基本一致，文中未列出. 图1B显示电磁辐射作用40 min后，属于酰胺I区域的谱线强度出现下降且展宽，其中属于无规卷曲的谱线突出. 磷酸二酯PO2对称伸缩在787 cm-1的谱线移动到782 cm-1，移动了5 cm-1. 图1D显示淋巴细胞拉曼光谱的变化，差异主要体现在： ① 1620 cm-1附近的谱线有轻微下降；② 1361 cm-1由尖锐变平滑；③ 位于850 cm-1附近的谱线强度增强，I850/I830仍小于1；④ 位于725 cm-1，745 cm-1的谱线在RF照射40 min后变得锐利且增强；⑤ 隶属于酪氨酸的640 cm-1位置的谱线变得锐利.
　　电磁辐射作用淋巴细胞60 min后，淋巴细胞的拉曼光谱与对照组拉曼光谱在一些谱线上有较明显的差异（图1C）. 电磁辐射作用60min后，淋巴细胞的拉曼光谱与正常对照组拉曼光谱的差异大部分与照射40 min的结果一样. 磷酸二酯PO2对称伸缩在787 cm-1的谱线移动到779 cm-1，移动了8 cm-1.
　　3讨论
　　电磁辐射对生物体的作用有致热效应和非致热效应. 致热效应使生物组织温升，生物分子发生取向作用，热作用到一定程度可引起严重损伤、变性. 非致热效应可影响细胞膜的活动能力，从而影响细胞的功能. 移动电话频率范围的电磁辐射对淋巴细胞的作用效应主要是非致热效应［1］.
　　从实验结果来看，功率密度为5 mW/cm2的900 MHz电磁辐射作用离体的淋巴细胞20 min后，拉曼光谱显示部分细胞在电磁辐射的作用下开始发生了一些微弱的变化. 位于1620 cm-1和1520 cm-1附近的谱线有轻微下降，这些变化提示脱氧核糖和碱基受到RF电磁辐射的作用，但作用不明显. 850 cm-1谱线强度相对增加，但是I850/I830仍小于1. 这显示酪氨酸仍处于埋藏状态［4］，但是出现由埋藏向暴露过渡的迹象. 隶属于CS键位于744 cm-1附近的谱线在电磁辐射20 min的淋巴细胞中没有出现，这与正常对照组的拉曼光谱一致，显示20 min的电磁辐射对淋巴细胞影响微弱，淋巴细胞仍保持其功能.

　　电磁辐射作用淋巴细胞40 min后，淋巴细胞的拉曼光谱出现了较多变化. 得到的拉曼光谱主要有两类，一种是没有明显的1520 cm-1和1157 cm-1谱线的拉曼光谱（图1B），谱线信息主要来源于细胞核；一种有明显的1520 cm-1和1157 cm-1谱线的拉曼光谱（图1D），1520 cm-1和1157 cm-1谱线是典型的类胡萝卜素的拉曼光谱. 对于淋巴细胞， 类胡萝卜素主要来源于细胞质的高尔基体［5-6］. 图1D的拉曼光谱反应了类胡萝卜素进入核区并聚集. 图1B显示电磁辐射作用40 min后，属于酰胺I区域的谱线强度出现下降且展宽，其中属于无规卷曲的谱线突出. 属于酰胺III区域，位于1250 cm-1附近谱线的变化也显示无规卷曲增加. 上述两个区域的变化显示蛋白有序结构减少、无序结构增加. 位于850 cm-1附近的谱线变化与电磁辐射20 min的结果类似，显示酪氨酸仍处于埋藏状态. 磷酸二酯PO2对称伸缩在787 cm-1的谱线移动到782 cm-1，移动了5 cm-1，提示DNA出现了无序状态. 图1D中1361 cm-1由尖锐变平滑，说明色氨酸由埋藏变暴露，提示蛋白侧链构象发生变化. 位于722， 745 cm-1的谱线在RF照射40 min后变得锐利且增强，提示蛋白变性出现了结合位点.
　　电磁辐射作用60 min后，淋巴细胞的拉曼光谱与正常对照组拉曼光谱的差异大部分与照射40 min的结果一样. 只是蛋白的无规则卷曲更加明显. 磷酸二酯PO2对称伸缩在787 cm-1的谱线移动到779 cm-1，移动了8 cm-1，提示DNA无序状态加剧. 即电磁辐射作用60 min后，淋巴细胞受电磁辐射的伤害加剧. 淋巴细胞在功率密度为5 mW/cm2的900 MHz电磁波作用20 min后，细胞受其影响不显著，细胞基本可以保持其形态和功能. 作用40 min后，细胞出现的变化显示细胞质高尔基体释放的类胡萝卜素进入到细胞和对细胞核进行保护. 但是随着电磁辐射的持续，很少能观察到包含类胡萝卜素信息的拉曼光谱，说明淋巴细胞的细胞核受到的伤害明显，细胞开始凋亡. 电磁辐射对淋巴细胞的作用可能是细胞膜和细胞质最先受到损伤，并在一定程度上保护、延缓了细胞核的损伤. 作用60 min的结果显示淋巴细胞出现了明显的损伤，显微镜下可观察到许多淋巴细胞的凋亡、解体.
　　5 mW/cm2功率密度相当于基站发射点附近的电磁辐射水平，本实验显示长期处于该种环境下，对人体血液可能造成损伤或功能的降低［3，7］，可引起染色体畸变、损伤与淋巴细胞免疫功能降低等现象［2，8］. 900 MHz电磁波作用于淋巴细胞的膜及膜内细胞质与细胞核，能量累积到一定程度可引起细胞膜、细胞质以至细胞核的损伤. 短时间处于该种环境，不致产生明显影响.

参考文献

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