关于机械应力下成骨细胞外信号调节激酶ERK1/2的早期变化

代写论文网：

　　　　　　　　 作者：曹阳，郑翼，陈扬熙，罗颂椒

【摘要】 　　目的： 观察体外培养的成骨样细胞在不同机械应力下细胞外信号调节激酶ERK1/2的表达变化. 方法： 采用四点弯曲细胞力学加载装置系统，对人成骨样细胞进行加力:频率0.5 Hz，加力板变形量4000 μ strain，按5，15，30 min和1 h不同时间段，使细胞发生单轴牵张和压缩应变. 运用Western Blot检测不同方向、不同作用时间的应力应变下细胞外信号调节激酶ERK1/2所产生的变化. 结果： 在4000 μ strain的周期性应力作用时，细胞外信号调节激酶ERK1/2在5 min内被迅速激活，磷酸化程度大幅升高，牵张及压缩应力均有类似表现；1 h左右恢复至基态水平. 牵张应力所引发的ERK磷酸化较压缩应力更强，其差异有统计学意义（P&<0.05）. 结论： 较大的应力应变可以在早期激活成骨细胞内的MAPK/ERK信号转导通路，牵张应力所产生的效应较压缩应力更为明显，机械应力参与了细胞外信号调节激酶的活化.
【关键词】 成骨细胞；机械应力；细胞外信号调节MAP激酶类；印迹法，蛋白质
　　【Abstract】AIM: To study the effect of mechanical strain on the expression of ERK1/2 in osteoblastlike cells in vitro. METHODS: Osteoblastlike cells were cultured and then subjected to mechanical strain by selfmade fourpoint bending system at a 0.5 Hz frequency for 5， 15， 30 min， 1， 3， 6 h， respectively. In each timephase， the cells were loaded with tension and compression stress at 4000 μ strain respectively. The phosphorylation levels of ERK1/2 were measured by Western Blot. Changes in the experiments were expressed as ratio to the controls. RESULTS: The selfmade fourpoint bending system supplied an accurate and effective cyclic uniaxial strain to the cultured adhesion cells in vitro. 4000 μ strain tension stimulus and compress stimulus induced the expression of ERK in a few minutes and the effect of tension strain was more significant (P&<0.05). It may be due to the distinct mechanotransductive mechanism of the different directional mechanical strain. CONCLUSION: Mechanical strain plays an important role in the activation of signaling pathway of MAPK/EPK in osteoblasts . The effect of tension strain is more significant than compress strain. Mechanical strain is involved in the activation of extracellular signal regulated kinase.
　　【Keywords】 osteoblasts; mechanotransduction; extracellular signal regulated MAP kinases;　　Blotting， Western
　　0　引言
　　细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase， ERKs)被认为是细胞对外界信号产生应答反应的一个上游枢纽，体外实验也已证实，机械力可以激活多种力学敏感型细胞，如内皮细胞［1］、平滑肌细胞［2］、成骨细胞和破骨细胞［3-4］，对细胞增殖、分化、功能、细胞周期及信号转导等多方面均有着重要的调控作用. 机械力对ERKs调控的研究少见报道. ERKs活化是以其蛋白分子上氨基酸的磷酸化为前提的，只有磷酸化的ERK才具有催化活性，所以本研究以同次电泳所得的蛋白条带pERK/ERK的比值作为比较和判断ERKs活性的依据，以此研究在不同机械应力下ERK1/2的早期变化.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　成骨样细胞株MG63（ATCC公司）培养试剂：DMEM培养基（Gibco公司），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司）75 cm2细胞培养瓶（No.353135， BD Falcon公司），六孔细胞培养板（Coring公司，美国），六孔板加力用离心支架（自制）离心机（LXJII型，上海医用分析仪器厂），CO2孵箱（Forma Scientific.Inc.，美国），倒置相差显微镜及照相系统（OLYMPUS IX70），鼠抗人pERK多克隆抗体 （Santa Cruz）；兔抗人ERK1/2多克隆抗体Santa Cruz）；辣根过氧化酶HRP标记的兔抗鼠IgG（Santa Cruz）；辣根过氧化酶HRP标记的羊抗兔IgG（Santa Cruz）；洗脱液配置： 990 mL/L β巯基乙醇684 μL; 100 mL/L SDS 20 mL 1 moL TrisHCl PH 6.76 25 mL; 加双蒸水至100 mL.

　　1.2　方法
　　1.2.1　成骨样细胞株MG63的传代培养将成骨样细胞株MG63按1×107/L的密度，接种于经多聚赖氨酸处理的聚苯乙烯培养瓶中，加入含100 mL/L新生小牛血清的DMEM培养基，置于CO2孵箱（37℃， 50 mL/L CO2）. 当MG63细胞生长形成单层，铺满培养瓶底80％以上时，在无菌条件下传代. 用DHanks液清洗培养瓶3次，加入25 g/L胰酶2 g/L EDTA，室温消化3~5 min， 1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养基，吹打细胞制成细胞悬液，按1×107/L密度分别置于各培养瓶中继续培养，隔天换液.
　　1.2.2　四点弯曲加力装置对MG63细胞的加力加力板准备: 将BD Falcon公司的75 cm2蓝盖斜颈细胞培养瓶从中间剖开，取细胞常规培养时用的底面（厚度1.15 mm），分成3 cm×8 cm大小的两块，周缘平滑四角圆钝，以避免加力过程中的应力集中. 洗净加力用细胞培养板，灭菌后接种细胞. 采用传代后的MG63细胞，胰酶消化离心后按2×105密度接种于加力板上（试验组和对照组同时种板），然后将其放入培养皿中，贴壁6 h后加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基，于CO2孵箱中培养48 h后，再将培养基换为无血清的DMEM培养液继续培养24 h，以同步化MG63的细胞周期. 采用Forcel四点弯曲体外细胞力学加载装置对接种在加力板上的人成骨样细胞进行加力，频率0.5 Hz，加力板变形量为4000 μ strain，按5，15，30 min和1 h不同时间段，使细胞在平行于贴壁方向上发生单轴牵张和压缩应变. 各加力组重复3次（n＝3），加力结束后分别收获细胞. 同时设定相应的对照组.
　　1.2.3　Western Blot 冰PBS冲洗贴壁生长的细胞3次，2 mL/次；滴加少量PBS液（500 μL）于培养板上，将细胞刮离培养板，收集入EP管内；按1∶5的体积比将改良RIPA蛋白提取液，加入EP管中，混匀；冰上裂解30 min；4℃低温离心30 min，1003 g，收集上清液；微孔板法进行微量蛋白定量测定（Bradford法），计算各组浓度；将各组蛋白以RIPA液稀释为1 g/L，然后加入同体积的上样缓冲液，煮沸3 min，-20℃保存待用. 待胶凝固后将标准10孔加样梳取出后，移至电泳槽内加入甘氨酸电极缓冲液，每泳道加样20 μL（即20 μg蛋白质）；SDSPAGE电泳，分离样品蛋白质，80 V恒压1 h，120 V恒压1.5 h，电泳完毕后切胶：6.5 cm×8.0 cm；用铅笔在预先裁好的PVDF膜左上角标记，甲醇处理3 s后放入双蒸水中水化3 h；电转缓冲液中浸泡3 mm滤纸、凝胶及PVDF膜5 h，由下到上以滤纸PVDF膜凝胶滤纸的顺序移入电转仪内，排除所有气泡；Hoefer TE 70半干电转仪（semidry transfer unit）65 mA恒流电转1.5 h，将蛋白质转移到PVDF（Polyvinylidene Difluoride）膜上；根据蛋白MARKER指示的位置，将PVDF膜分成上下两部分，分别用于检测Mr×103为65的NFκB和42的Actin，获得最佳的内参照数据. 将PVDF膜放入封闭缓冲液室温摇床振荡1 h，分别加入兔抗人NFκB（p65）多抗及羊抗人Actin多抗，4℃杂交过夜；TTBS漂洗10 min×3次，对应上述不同的膜，分别加入二抗：HRP标记的羊抗兔IgG及兔抗羊IgG，37℃恒温杂交1 h；TTBS漂洗10 min×3次，最后用不含Tween20的TBS漂洗10 min：吹干PVDF膜，将Western Blot reagent A液和B液按1∶1比例混匀后，均匀地涂在其膜上1 min；倒去发光试剂，在暗室内将X光片置于其上曝光60 s后放入暗盒. 冲洗X光片，扫描并进行计算机图像分析. 将同次电泳所得的NFκB及Actin条带灰度值相比，得到各样本组NFκB/Actin的灰度比值. 将同次电泳所得的pERK及ERK条带灰度值相比，得到各样本组pERK/ERK的灰度比值.
　　统计学处理： Western Blot实验结果以x±s表示，采用SPSS 10.0软件包，数据进行方差分析及LSDt检验. aP&<0.05认为差异有统计学意义.

　　2　结果
　　当成骨样细胞（MG63）受到4000 μ strain的周期性应力作用时，ERK在5 min内被迅速激活，磷酸化程度大幅升高，牵张及压缩应力均有类似表现（P&<0.01，图1，表1）；随后ERK的磷酸化虽有一定程度回落但仍在高位持续一段时间（30 min张应力组有小幅下降），1 h左右恢复至基态水平. 组间比较（图2）可见，5 min时牵张应力所引发的ERK磷酸化较压缩应力更强，其差异有统计学意义（P&<0.05）；15 min组，张应力及压应力对ERK活性均有激活作用，但组间比较无统计学差异（P&>0.05）. 表14000 μ strain的应力应变对成骨样细胞ERK磷酸化水平的影响（略）
　　3　讨论
　　3.1　四点弯曲细胞加力装置及应力应变的选择
　　本研究我们研发设计了四点弯曲细胞力学加载仪. 该装置通过梁变形原理，利用数控步进电机使培养板发生应变，从而间接地对贴壁生长于其表面的细胞产生一个精确、恒定、统一的周期性单轴应力. 以往研究多数采用静牵张应力或静压缩应力来探讨机械刺激的细胞效应，由于细胞的适应性生长且力值偏大，因而与体内细胞的实际受力情况有较大的差别. 有学者［5］报道，过大的力值将使细胞不能附着，或使细胞和细胞骨架受到损害. 认为细胞受力大小应以细胞应变量（μ strain）来表示，10 000 μ strain即相当于1%的形变. 人在生理状态下细胞应变量约为1000 μ strain，而在剧烈运动时细胞应变量小于4000 μ strain［6-7］. 我们采用低频率(0.5 Hz)的周期性单轴应力（以尽量减少加力过程中培养液波动对细胞产生的流体剪切力［5］），以4000 μ strain大小的应力应变对成骨细胞进行加力. 加力后用倒置相差显微镜观察加力培养板上的细胞，证实细胞的贴壁及生长情况良好，脱落率极低，完全符合本实验的要求.
　　3.2　成骨细胞的力学信号
　　转导机制机械性应力应变是骨骼构建与重塑的基本动因，处于终身改建状态的牙槽骨是口腔正畸临床治疗得以实现的生理基础，所以研究细胞的力学信号转导机制具有非常重要的意义. 以往对于体外培养的细胞力学信号转导过程的研究，多将目光放在力学刺激细胞应答产物上，以某种产物的增减来说明力学信号的转导与研究者所关注的某一个信号路径是否相关，这样的研究存在一定的局限性. 机械力刺激是骨发生改建的重要调节因素［8］. 当力学信号加载于细胞上时，应力应变所带来的细胞膜表面结构的变化可能是最直接的. 应力应变使某些相关蛋白分子位点上的氨基酸发生磷酸化，从而直接改变了这些酶的活性，并由此开始，同时激活细胞内的多个酶促体系，最终产生细胞对力学信号的应答，而本研究关注的ERK便是这些早期变化的一个重要枢纽.
　　3.3　机械力信号对成骨细胞ERK的激活作用及影响
　　因素本研究证实，较大的应力应变可以在早期激活成骨细胞内的MAPK/ERK信号转导通路，牵张应力所产生的效应较压缩应力更为明显. 在细胞增殖、分化、功能、细胞周期及信号转导等多方面均起着重要调控作用的ERK可被力学刺激迅速激活（5 min内）. 同时，ERK的激活与多个力学信号可能的转导通道密切相关，所以深入研究其激活机制，对于最终揭示机械力这一物理信号是如何转化为化学信号将是有极大帮助的. 在研究力学信号转导过程时，不仅需要考虑力值的大小，应力应变的性质也是影响因素之一，不同的力学环境下的结果存在可比性差异，这又提示我们在进行同类研究对比时应更为全面地考虑多种因素所产生的不同作用. 本研究认为，在力学信号的转导过程中，蛋白质分子上氨基酸残基所发生的磷酸化要远早于基因的变化，可能是最早发生、具有实际生理效应的可逆化过程，是机械化学信号偶联的起始关键.
【参考文献】
　　［1］Yang SH， Sharrocks AD， Whitmarsh AJ. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades ［J］. Gene， 2003，320（27）:3-21.

　　［2］Reusch HP， Chan G， Ives HE， et al. Activation of JNK/SAPK and ERK by mechanical strain in vascular smooth muscle cells depends on extracellular matrix composition ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 1997，237（2）:239-244.

　　［3］Gebken J， Luders B， Notbohm H， et al. Hypergravity stimulates collagen synthesis in human osteoblastlike cells: Evidence for the involvement of p44/42 MAP kinase (ERK1/2)［J］. J Biochem (Tokyo)， 1999，126(4):676-682.

　　［4］Wadhwa S， Godwin SL， Peterson DR， et al. Fluid flow induction of cyclooxygenase 2 gene expression in osteoblasts is dependent on an extracellular signalregulated kinase signaling pathway［J］. J Bone Miner Res， 2002，17(2):266-274.

　　［5］Owan I， Burr DB， Turner CH， et al. Mechanotransduction in bone: Osteoblasts are more responsive to fluid forces than mechanical strain［J］. Am J Physiol， 1997，273(3 pt 1):c810-c815.

　　［6］Fermor B， Gundle R， Evans M， et al. Primary human osteoblast proliferation and prostaglandin E2 release in response to mechanical strain in vitro［J］. Bone， 1998，22(6):637-643.

　　［7］Burr DB， Milgrom C. In vivo measurement of human tibial strains during vigorous activity［J］. Bone， 1996，18(5):405-410.

　［8］Lanyon LE. Control of bone architecture by function load bearing［J］. J Bone Miner Res， 1992，7:S369-S375.