关于乳腺癌患者血浆RASSF1A基因启动子甲基化的意义

【摘要】 　　目的： 探讨乳腺癌患者血浆、肿瘤组织中RASSF1A基因启动子甲基化与临床病理等因素的相关性. 方法： 采用甲基化特异性PCR方法，分别检测68例乳腺癌患者血浆、肿瘤组织及癌旁腺体组织，以及12例良性乳腺疾病患者的血浆和乳腺组织中RASSF1A基因启动子甲基化状况. 结果： 乳腺癌组织RASSF1A基因启动子甲基化频率47.1%（32/68），患者血浆中同样DNA变异检出率33.8%（23/68）. 血浆中DNA甲基化状况与乳腺癌组织的甲基化状况显著相关（r=0.906， P=0.001）. 检测血浆中RASSF1A基因启动子甲基化的敏感性71.8%，特异性97.2%，肿瘤组织及血浆中游离DNA甲基化异常与临床分期，病理类型，肿瘤大小，ER，PR和cerbB2状况无相关性（P&>0.05）. 乳腺癌组织中未检测到RASSF1A基因启动子甲基化的血浆中、乳腺良性疾病患者血浆中均未检测到该基因甲基化变异. 结论： 乳腺癌患者血浆中RASSF1A基因启动子甲基化与肿瘤组织中的变异频率相关.
【关键词】 乳腺肿瘤；RASSF1A基因；甲基化
　　【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between promoter methylation of tumor suppressor gene RASSF1A in plasma and clinicopathological features of breast cancer. METHODS: Methylation specific PCR was used to measure the promoter methylation status in plasma， paired tumor tissue and paracancerous normal tissue of 68 patients with breast cancer and in plasma and mammary gland of 12 patients with benign breast diseases. RESULTS: The detection rate of RASSF1A gene promoter hypermethylation was 47.1%(32/68) in tumor tissue and 33.8%(23/68) in paired plasma. RASSF1A gene hypermethylation in plasma was significantly correlated to that in tumor tissue ( r=0.906， P=0.001). The sensitivity of RASSF1A gene hypermethylation detection in plasma was 71.8% and the specificity was 97.2%.The aberrant methylation of RASSF1A gene in tumor tissue and plasma had no correlation to patients age， tumor stage， tumor size， histological type， ER， PR， and receptor status (P&>0.05). No aberrant methylation of RASSF1A gene was found in the plasma samples from the patients with benign breast diseases and from the ones without gene methylation in tumor tissue. CONCLUSION: The aberrant RASSF1A gene promoter methylation in plasma of breast cancer patients is significantly correlated to that in breast cancer tissue.
　　【keywords】 breast neoplasms; RASSF1A; methylation
　　0 引言
　　乳腺癌发生发展伴随着许多基因的改变，其中包括了抑癌基因的失活，如基因突变、染色质丢失和启动子异常甲基化等. Ras相关区域家族1A（ras association domain family 1A， RASSF1A）是2000年发现的一种候选抑癌基因［1］，其失活在乳腺癌的发生发展中具有重要意义［2-4］. 我们采用甲基化特异性PCR方法检测乳腺癌患者血浆、肿瘤组织和癌旁腺体组织中RASSF1A基因启动子甲基化的状况，并研究其临床意义.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　经病理学检查确诊后进行手术治疗的乳腺癌患者68例，均未行术前化疗. 包括乳腺癌改良根治术58例，乳腺单纯切除6例，乳腺癌根治术4例. 对年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移、临床分期、雌性激素受体、孕激素受体和cerbB2情况进行列表（表1）. 同期采集10例乳腺纤维腺瘤和2例乳腺增生症患者的血浆作为正常对照.
　　1.2　方法
　　术前采用BD真空采血管采集乳腺癌患者肘静脉血5 mL，EDTANa2 抗凝，于4℃条件下2000 g离心10 min，小心转移上层血浆至1.5 mL离心管中，再于4℃条件下12 000 g离心10 min，将上清以200 μL/管分装后置-80℃冰箱中保存. 术中取乳腺癌组织，距离肿瘤边缘5cm以上取癌旁腺体组织，分别标记于-80℃保存. 血浆DNA抽提按照QIAamp Blood Mini Kit操作说明书进行. 肿瘤及癌旁组织取50 mg剪碎后研磨，加入组织裂解液500 μL，50℃水浴1 h，再加入蛋白酶K至终浓度100 mg/L，50℃水浴3 h，用酚氯仿（体积比1∶1）和氯仿异戊醇（体积比24∶1）各抽提DNA1次，加入1/10体积乙酸钠和2倍体积的冰乙醇，沉淀DNA，加适量TE溶液溶解，紫外分光光度仪测定DNA浓度和纯度. 分别取血浆DNA50 μL(20 μg/L)，肿瘤和癌旁组织DNA20 μL(50 μg/L)，溶于TE溶液45 μL中，加入3 mol/L NaOH 5μL，至终浓度0.3 mol/L，37℃变性20 min，加入10 mmol/L氢醌30 μL和3 mol/L，pH 5.0亚硫酸氢钠520 μL，50℃水浴16 h. 用Wizard DNA Cleanup System( Promega 美国)纯化， 溶于灭菌双蒸水30 μL，-20℃保存. RASSF1A基因启动子甲基化引物由上海博亚公司合成，采用1.5对引物进行半巢式MSP扩增. 反应体系50 μL包括：亚硫酸氢钠处理的DNA模板2 μL，双蒸水36.2 μL，10×buffer 5 μL，氯化镁4 μL，Taq聚合酶0.3μL，dNTP 0.5 μL，引物MU379，引物ML730个1μL. 反应条件：95℃变性5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，74℃ 30 s，共30循环；72℃ 7 min. 取第1轮PCR反应产物1/50用引物MU379和引物ML561进行第2轮扩增，反应体系及条件同上. 经半巢式MSP两轮扩增后获得产物片段长度为205 bp，此片段共有16个CpG位点，已甲基化的DNA205 bp的产物片段中有两个特异性内切酶TaqI（5′TCGA3′）的酶切位点，分别位于6和16CpG位点，可以将产物片段切成90，81和34 bp的小片段，前两个片段融合在一起，而34 bp的小片段不显示. 未甲基化的DNA则不能被切断. 用3 mol/L乙酸钠和无水乙醇将PCR产物进行沉淀，纯化PCR产物. 取样10 μL，特异性内切酶TaqI 1 μL，10×TaqIbuffer 2 μL，加双蒸水至20 μL，65℃酶切2 h. 然后将酶切产物在25 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外凝胶成像系统观察分析结果.
　　统计学处理：运用SPSS10.0统计软件进行χ2检验及相关分析，P&<0.05为有统计学意义.
　　2　结果
　　肿瘤组织及血浆中RASSF1A基因甲基化异常频率与年龄，组织类型，肿瘤大小，临床分期，ER，PR和cerbB2状况无相关性(表1) . 乳腺癌患者肿瘤组织中RASSF1A基因启动子甲基化异常检出率为47.1%( 32/68)，在其相应配对血浆标本中检出率为33.8%(23/68，表2). 肿瘤组织中RASSF1A基因甲基化异常与血浆中甲基化相关(r=0.906，P=0.001，表2). 在对应癌旁正常腺体组织及12例良性乳腺疾病患者对照血浆中均未检出甲基化异常. 检测血浆中RASSF1A基因甲基化异常的敏感性为71.8%， 特异性为97.2%. 表1乳腺癌患者肿瘤组织及血浆RASSF1A基因启动子甲基化与临床病理特征(略)表2肿瘤组织与血浆中RASSF1A基因甲基化(略)

　　3　讨论
　　RASSF1有7个转录本，其中RASSF1A是主要转录本之一，长1873 bp，含6 个外显子，编码340个氨基酸. 推测RASSF1A蛋白可能参与阻断RAS激活生长效应的信号途径；或者抑制内源性cyclinD1， cyclinD3的积累，使细胞周期阻断在G1/S期，从而抑制恶性细胞增殖. Burbee等［1］在乳腺癌组织和细胞株中发现了RASSF1A基因的甲基化. 我们结果也符合血液中变异DNA来自于原发肿瘤. 与其他研究比较，本研究中肿瘤组织和血浆中RASSF1A甲基化的阳性率均偏低. Dulaimi等［2］在34例乳腺癌组织中发现22例（65%）存在RASSF1A基因甲基化，其中19例（56%）同时在血清DNA的RASSF1A基因甲基化. Rykova等［3］和Skvortsova等［4］用此法研究了乳腺癌患者循环DNA中基因甲基化，发现细胞表面结合的DNA比游离DNA在甲基化检测方面具有更高的阳性率，其中Skvortsova等［4］的研究中RASSF1A甲基化的检出率可以由15%提高到65%. 我们在乳腺癌患者血浆中游离DNA片段RASSF1A甲基化与对应肿瘤组织RASSF1A甲基化具有显著相关性，提示有可能通过检测血浆循环DNA的RASSF1A甲基化来筛检乳腺癌. Krassenstein等［5］在22例乳头分泌物中检测到RASSF1A基因的甲基化. Pu等［6］联合检测了乳腺癌细针穿刺活检标本中RARβ2，RASSF1A和CyclinD2等3个基因的异常甲基化，表明联合检测阳性率高达96%，显著高于任一基因的单独检测，并且与病理结果高度一致.
　　许多学者研究了乳腺癌RASSF1A基因异常甲基化与临床特点之间的关系，但是报道结果不尽相同，可能与样本含量差异和检测手段不同有关. Chen等［7］发现，RASSF1A甲基化频率在不同年龄、组织类型、临床分期患者之间均无差异，且与激素受体的表达也无明显相关. 李咏梅等［8］的研究也显示RASSF1A 基因启动子甲基化与患者的年龄，病理组织学类型，临床分期，淋巴结转移无相关性. 与本实验结果相一致. 以往认为血液中检测到肿瘤DNA变异与肿瘤分期相关，有部分研究也表明血清DNA变异阳性更多见于晚期、转移的恶性肿瘤. 文献报道应用PCR技术检测血液中游离肿瘤变异DNA的敏感性及特异性差异较大，考虑由于血液循环中DNA量少、实验操作要求较高、具体方法各异引起的差异.
【参考文献】
　　［1］Burbee DG， Forgacs E， ZochbauerMuller S， et al. Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers malignant phenotype suppression ［J］ . J Natl Cancer Inst， 2001，93(9):691-699.

　　［2］Dulaimi E， Hillinck J， Ibanez de Caceres I， et al. Tumor suppressor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2004，10(18):6189-6193.

　　［3］Rykova EY， Laktionov PP， Skvortsova TE， et al. Extracellular DNA in breast cancer: Cellsurfacebound， tumorderived extracellular DNA in blood of patients with breast cancer and nonmalignant tumors［J］. Ann NY Acad Sci， 2004， 1022:217-220.

　　［4］Skvortsova TE， Rykova EY， Tamkovich SN， et al. Cellfree and cellbound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumourrelated gene methylation［J］. Br J Cancer， 2006， 94(10):1492-1495.

　　［5］Krassenstein R， Sauter E， Dulaimi E， et al. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation［J］. Clin Cancer Res， 2004， 10(1): 28-32.

　　［6］Pu RT， Laitala LE， Alli PM， et al. Methylation profiling of benign and malignant breast lesions and its application to cytopathology［J］. Mod Pathol， 2003， 16(11):1095-1101.

　　［7］Chen CM， Chen HL， Hsiau TH， et al. Methylation target array for rapid analysis of CpG island hypermethylation in multiple tissue genomes［J］. Am J Pathol， 2003， 163(1):37-45.

　　［8］李咏梅，曹芳，曹新. 乳腺癌RASSF1A基因表达及启动子区甲基化研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2006， 26(7):496-500.