关于Leptin对Leptin受体在GH3细胞中表达的影响

　　　　　　　　作者：刘亚莉，钟延清，朱运龙，迟素敏

【关键词】 瘦素；GH3细胞；leptin受体
　　【Abstract】 AIM: To observe the influence of leptin on the expression level of leptin receptors (OBR) in the cultured GH3 cells. METHODS: RTPCR method was used to observe the expression of leptin receptors (OBR) and its change in GH3 cells. RESULTS: There were three subtypes of leptin receptors mRNA expressed in GH3 cells， including OBR (common form)， OBRa (short form) and OBRb (long form). After leptin (10-8 mol/L) treatment for 48h， OBRa and OBRb mRNA levels in GH3 cells were increased to (154±11）％ and (188±9）％. CONCLUSION: Leptin might regulate function of GH3 cells through leptin receptors in GH3 cells directly， including growth， proliferation and GH secretion of GH3 cells.
　　【Keywords】 Leptin；GH3 cell；leptin receptor
　　0　引言
　　瘦素(Leptin)是由脂肪组织分泌的一种循环激素，具有多种生理功能，可调控能量代谢、摄食、机体脂肪的沉积以及神经内分泌和生殖功能. Leptin受体（leptin receptor， 也称OB gene receptor， OBR）属于细胞因子Ⅰ型受体，已发现至少有5种OBR的异型体，分别以a， b， c， d， e来命名. 根据细胞内位点的不同又把OBR分为长受体（OBRb）和短受体. 其中OBRb是长受体，也是主要的效应受体，含有一个由340个氨基酸组成的细胞内位点，这个细胞内位点被认为是Leptin信息传递的第一步；短受体包括OBRa，OBRc，OBRd和OBRe，具有信息转运功能. 有研究显示，Leptin受体在下丘脑、肺、肾、脉络丛及生殖器官等多种组织中均有表达. Yonekura等［1］发现在牛和大鼠的垂体前叶有Leptin及Leptin 短型受体的表达. 在羊的下丘脑有Leptin受体的基因表达［2］，Leptin受体在人的正常垂体和垂体瘤中均有表达，但在不同种属的不同部位OBR的表达形式不一［3-4］. 本研究旨在用RTPCR方法观察Leptin受体3种亚型（OBR，OBRa以及OBRb）在大鼠GH3细胞中的表达，探讨Leptin对大鼠GH3细胞中leptin受体表达的影响.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　GH3细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心); Leptin， 胰蛋白酶和EDTA(美国Sigma公司)；DMEM(美国Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；反转录试剂盒，PCR反应试剂盒(美国Promega公司)；Taq DNA聚合酶和DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)；琼脂糖(洛阳华美生物工程公司). 所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成.
　　1.2　方法
　　1.2.1　细胞培养大鼠生长激素瘤GH3细胞在含120 mL/L小牛血清DMEM培养液中常规培养、传代，加入2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA (1∶1)消化细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入含120 mL/L小牛血清的DMEM培养液，轻吹起细胞，调整细胞密度，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔100 mL，移入CO2孵箱，在37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养，24 h换液，之后每隔48 h换液1次.
　　1.2.2　逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）
　　1.2.2.1　细胞总RNA的提取GH3细胞以5×108/L的密度接种于直径6 cm的培养皿中，移入CO2孵箱中培养，培养条件同上. 培养5 d后，收集细胞，用预冷灭菌的生理盐水洗涤沉淀，将1 mL Trizol加到培养皿中，轻摇培养皿至液体浸润到各处，待细胞悬浮后，将液体移入1.5 mL离心管中，冰上静置5 min，加入200 mL氯仿，震荡混匀，于室温下静置15 min，4℃，12 000 g离心15 min，小心吸取上层水样（约300～400 mL），转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上沉淀10 min，4℃，12 000 g离心10 min，RNA沉附于管底或管壁. 750 mL/L乙醇洗涤1次，4℃，7500 g离心10 min，去除乙醇液体，将RNA 沉淀风干，用20 mL无RNA酶水55℃溶解15 min，-20℃保存备用. 所有获取的RNA 用分光光度计读取A值，计算RNA的含量，并用A260 nm/A280 nm比值判断RNA的纯度.
　　1.2.2.2　cDNA的合成以提取的总RNA为模板，cDNA合成反应体系为20 μL，包括提取的总RNA 5 μL，25 mol/L MgCl2 4 μL，10×PCR缓冲液2 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 mL， RNA酶抑制剂0.5 μL，AMV反转录酶1 μL，Oligo dT 1 μL，其余用无RNA酶水补充至20 μL，混匀后42℃水浴60 min，沸水浴5 min灭活反转录酶.
　　1.2.2.3　PCR反应取合成的cDNA模板1 μL，依次加入10×PCR缓冲液2.5 μL，4×dNTP混合物1 μL，Taq DNA聚合酶0.125 μL，人OBR， OBRa和OBRb引物各0.5 μL（OBR引物：sense：5′CTCCGCACTCACAGGCAACA3′， antisense：5′TGGATCGGG
CTTACAACAA3′；OBRa引物：sense：5′CCTATCGAGAAATATCAGTTTA3′， antisense：5′TCAAAGA
GTGTCCGCTCTCT3′；OBRb引物：sense：5′AGAATTGTTCCTGGGCACAAG3′， antisense：5′ACACTCAT
CCTCACAGGTTCC3′），加无菌去离子水补至25 μL，首次循环94℃ 4 min，然后94℃变性1 min，OBR 63℃退火1 min，OBRa 55℃退火1 min，OBRb 65℃退火1 min，72℃延伸1 min，末次循环72℃延伸6 min. 以不加入模板为阴性对照组，18 S为内对照（18 S引物：sense：5′CGGCTACCACATCCAAGGAA3′，antisense：5′GCTGGAATT ACCGCGGCT3′）. 取PCR产物10 μL，在20 g/L琼脂糖凝胶电泳以Φ×174 DNA/HaeⅢ Marker为标准分子量，经凝胶图像分析仪分析结果.
　　1.2.2.4　半定量RTPCR将提取的细胞总RNA 取1～2 mL，初步进行紫外分析定量. 取5 mg RNA反转录成cDNA，以18 S为内对照进行PCR. 取各组细胞RTPCR产物10 mL，以Φ×174 DNA/HaeⅢ Marker为标准分子量，在20 g/L琼脂糖中进行凝胶电泳，电泳结果用UVP成像系统采集染色条带后转入计算机，并用图像分析软件分析各条带密度. 将各产物的密度值与内对照18 S密度值进行比较得到其表达的相对值. 以对照组产物表达的相对值为100%，其余各组表达的相对值与对照组相比较以计算其表达的变化率. 变化率(%)=(试验组值/对照组值)×100%.
　　统计学处理: 所有数据均以x±Sx表示，组间均数比较用t检验处理，多组间均数比较用单因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2　结果
　　2.1　OBR在大鼠GH3细胞的表达OBR，OBRa及OBRb的引物进行RTRCR后，产物经琼脂糖凝胶电泳，从凝胶图像上可以看到，大鼠GH3 细胞有OBR， OBRa和OBRb的表达，3个条带与预期片段大小相符（图1）.
　　2.2　Leptin可上调大鼠GH3细胞OBRa和OBRb mRNA的表达半定量RTPCR实验结果显示，Leptin（10-8 mol/L）作用于体外培养的大鼠GH3 细胞48 h后其受体OBRa 和OBRb mRNA表达分别增加至（154±11）％和（188±9）％，可显著上调大鼠GH3细胞OBRa和OBRb mRNA的表达（图2）.

　　3　讨论
　　1994年，Zhang等用定位克隆技术克隆了小鼠的肥胖基因(ob gene)及人类的同源序列，基因编码产生由167个氨基酸残基构成的蛋白质，N端有由21个氨基酸残基构成的信号肽，信号肽切割后成为由146个氨基酸组成的成熟蛋白质，即为Leptin，是调节体重和摄食的一个重要因素［5-6］.
　　Lin等［4］发现在猪的垂体前叶有长型Leptin受体的表达，在人垂体中也有OBRb mRNA的表达. 免疫组织化学双染色显示在大鼠垂体前叶有OBR和垂体激素表达的双重定位［7］，表明主要属生长激素（GH）分泌细胞(97.4±1.3)%（GH阳性细胞/OBR阳性细胞），而催乳素分泌细胞、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素β和促甲状腺激素β/黄体生成素β阳性细胞不到1%. GH不仅参与机体的生长发育，通过影响能量代谢对机体组成和脂肪分布也起着一定作用，有关Leptin对GH影响的研究越来越多的被人们关注. 我们的实验结果显示，在大鼠GH3细胞上有OBR的表达，包括其长型(OBRb)，短型(OBRa)和通用型(OBR)受体mRNA的表达，提示Leptin可能通过其在GH3细胞上的相应受体直接调控GH3细胞的功能，影响GH3细胞的生长和GH的分泌.
　　很多生理性或病理性因素能影响受体的亲和性、受体数量、膜受体传递信息的能力和激素作用的受体后环节，这些调节可以造成激素反应的脱敏或超敏现象. 对许多内分泌细胞来说，激素与受体的结合增加了受体进入细胞内的速度，因此，增加细胞内和被分解的受体数量，加快受体分解，最终导致细胞表面受体数量的减少，这是一种负反馈调节. 虽然大多数激素诱导其受体下调，但也有一些激素如催乳素，起到正向同源性调节作用. 例如，用催乳素刺激肝细胞能增加催乳素受体合成及受体数量，加强细胞对这个激素的反应. 除了直接调节受体，激素与受体的结合还能引起其他形式的调节，它可以发生在受体水平、 受体后水平或两者皆有. 半定量RTPCR实验结果发现Leptin可上调大鼠GH3细胞中Leptin受体基因的表达，增加OBRa和OBRb mRNA的含量，该作用与通常的激素对其受体的反馈性下调不一致，有可能对其受体起到正向同源性调节作用，考虑这可能与Leptin抵抗有关系. 肥胖患者的血清Leptin水平很高，但因Leptin抵抗无法实现其调控能量代谢和体质量的作用，那么Leptin受体的上调是否与肥胖患者发生leptin抵抗有关？这一结果为肥胖的研究提供了一个新思路，对于研究肥胖及其相关疾病有一定意义. 但是另一方面转录后还要经过修饰、加工和翻译过程，Leptin对GH3细胞Leptin受体蛋白水平的影响我们并未检测，虽然其mRNA水平上调，但其转录后的翻译、修饰等过程最终形成有功能的能结合leptin 并将信号传入细胞内的受体蛋白量的变化尚不清楚，其受体蛋白水平有可能会升高或降低. 关于受体蛋白水平的变化有待进一步的检测.

参考文献

　　［1］Yonekura S， Senoo T， Kobayashi Y， et al. Effects of acetate and butyrate on the expression of leptin and shortform leptin receptor in bovine and rat anterior pituitary cells［J］. Gen Comp Endocrinol， 2003， 133(2):165-172.

　　［2］Adam CL， Archer ZA， Findlay PA， et al. Hypothalamic gene expression in sheep for cocaine and amphetamineregulated transcript， proopiomelanocortin， neuropeptide Y， agoutirelated peptide and leptin receptor and responses to negative energy balance［J］. Neuroendocrinology， 2002， 75(4):250-256.

　　［3］Jin L， Burguera BG， Couce ME， et al. Leptin and leptin receptor expression in normal and neoplastic human pituitary evidence of a regulatory role for leptin on pituitary cell proliferation［J］. J Clin Endocrinol Metab， 1999， 84:2903-2911.

　　［4］Lin J， Barb CR， Kraeling RR， et al. Growth hormone releasing factor decreases long form leptin receptor expression in porcine anterior pituitary cells［J］. Domest Anim Endocrino， 2003， 24(2): 95-101.

　　［5］Zhang Y， Proenca R， Maffei M， et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］. Nature， 1994， 372(6505): 425-432.

　　［6］Houseknecht KL， Mantzoros CS， Kuliawat R，et al. Evidence for leptin binding to proteins in serum of rodents and humans: Modulation with obesity［J］. Diabetes， 1996， 45(11): 1638-1643.

　　［7］Sone M， Nagata H， Takekoshi S， et al. Expression and localization of leptin receptor in the normal rat pituitary gland［J］. Cell Tissue Res， 2001， 305(3): 351-356.