关于SB203580防治大鼠高氧肺损伤的作用与机制

　　　　　　　　 作者：罗莉漫，孙志强，余健，聂国明，刘静，邹敏书

【摘要】 　　目的：探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)特异性抑制剂SB203580对新生大鼠高氧肺损伤产生保护作用的机制. 方法：160只新生大鼠随机分为空气对照组、高氧肺损伤组、高氧肺损伤+SB203580组和高氧肺损伤+生理盐水组，建立模型. 作用12， 24， 72 h和1 wk后，分别处死大鼠. 取大鼠72 h的左肺以Western Blot法检测p38MAPK的表达情况，取大鼠4个时相点的右肺以ELISA法检测IL8和TGFβ1的含量. 结果：72 h时， 高氧肺损伤组和高氧肺损伤+生理盐水组p38MAPK呈阳性表达；在这两个组中，肺组织IL8 和TGFβ1浓度随时间延长呈持续上升趋势，在各时相点均高于空气对照组和高氧肺损伤+SB203580组（P&<0.01）. 结论：SB203580能够通过阻断p38MAPK表达，进而抑制IL8和TGFβ1表达来减轻新生大鼠高氧肺损伤.
【关键词】 肺/损伤; 高氧；p38丝裂素活化蛋白激酶；IL8；TGFβ1
　　【Abstract】 AIM: To investigate the mechanism of protection from hyperoxiainduced lung injury in newborn rats by SB203580， a p38MAPK specific inhibitor. METHODS: A total of 160 newborn rats were pided into air control group， hyperoxiainduced lung injury group， hyperoxiainduced lung injury + SB203580 group and hyperoxiainduced lung injury + sodium chloride group randomly. At the time points of 12， 24， 72 h and 1week， rats were executed， respectively. Left lungs at the time point of 72 h were availed to detect the expression of p38MAPK by Western Blot， and right lungs at the 4th time point were availed to detect the concentrations of IL8 and TGFβ1 by ELISA. RESULTS: At the time point of 72 h， p38MAPK was expressed positively in hyperoxiainduced lung injury group and hyperoxiainduced lung injury + sodium chloride group;in the two groups， the concentrations of IL8 and TGFβ1 increased significantly with time going on. And at each time point， their concentrations were higher than those in the air control group and hyperoxiainduced lung injury + SB203580 group (P&<0.01）. CONCLUSION: Hyperoxiainduced lung injury in newborn rats can be relieved by the treatment of SB203580 through blocking the expressions of p38MAPK， then inhibiting the expression of IL8 and TGFβ1.
　　【Keywords】 lung/injury; hyperoxia; p38 mitogenactivated protein kinase; IL8; TGFβ1
　　0 引言
　　我们在前期研究中发现，大鼠长时间暴露于高氧环境后，p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase， p38MAPK）得以激活并介导了急性肺损伤，p38MAPK特异性抑制剂SB203580对这种损伤具有明显的保护作用［1］， 但具体的机制尚不清楚. 有研究表明，白介素8（interleukin8， IL8）和转化生长因子β1（transforming growth factorβ， TGFβ1）均在高氧肺损伤中发挥了重要作用［2-3］. 我们以SB203580处理建立新生大鼠高氧肺损伤模型，观察其对肺组织IL8和TGFβ1表达的影响，探讨临床应用SB203580预防和治疗高氧肺损伤的可行性.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　出生12 h内的SD大鼠160只（第三军医大学大坪医院实验动物中心），体质量6~8 g. 兔抗大鼠磷酸化的p38MAPK多克隆抗体（Santa Cruz公司）;Western Blot使用效价为1∶500. 生物素化的羊抗兔IgG，SABC复合物及DAB（武汉博士德公司）; p38MAPK特异性抑制剂SB203580（美国Sigma公司）; IL8和TGFβ1 ELISA检测试剂盒（美国Mega诊断试剂有限公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 分组及建模
　　将大鼠随机分为4组：空气对照组、高氧肺损伤组、高氧肺损伤+SB203580组及高氧肺损伤+生理盐水组，每组40只. 所有高氧肺损伤组置于常压高氧仓中，氧体积分数&>0.95，CO2体积分数≤0.05；空气对照组置于同一室内，空气中氧体积分数为0.21. 高氧肺损伤+ SB203580组从高氧暴露第1日开始，给予SB203580（配制成10 μmol/L） 5 mg/kg腹腔注射，1/d，共3 d. 高氧肺损伤+生理盐水组给予生理盐水5 mg/kg腹腔注射，1/d，共3 d. 所有高氧肺损伤组每天开仓1次，添加水及垫料，并将母鼠置于空气中休息1 h，累计连续暴露于高氧环境72 h. 以上4组环境温度均控制在21~25℃，湿度60%~70%.
　　1.2.2 标本制备
　　于12，24，72 h和1 wk后等4个时相点断头法分别处死10只大鼠，倒立尽量放血. 打开胸腔后，暴露心脏和双肺，完整地取出双肺（注意剔除心脏和气管等非肺组织），置于冰冷的生理盐水中漂洗，洗去血液. 分别取左肺、右肺组织，按每克组织加入10 μL匀浆缓冲液［Tri缓冲液（TBS）∶苯甲基磺酰氟（PMSF）＝20∶1］，高速分散器将组织匀浆，置于冰浴20 min， 13 000 g高速离心20 min， 取上清液.
　　1.2.3 Western Blot检测
　　取72 h的左肺匀浆离心后的上清液， Lowry法测定所提取蛋白的浓度. 加入上样缓冲液后煮沸5 min， -20℃保存备用. 配制40 g/L浓缩胶和120 g/L分离胶，每孔加入上述样品20 μL，进行SDSPAGE. 取出分离胶浸在转移缓冲液中，等大的硝酸纤维膜对齐放在分离胶上，并在分离胶和硝酸纤维膜两侧各放三张等大的滤纸，在微型蛋白转印系统中60 V电压转移1 h. 以50 g/L脂奶粉TBST室温封闭2 h，加入兔抗鼠磷酸化p38MAPK抗体（1∶500），4 ℃过夜. TBST洗涤3次（15 min/次），加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶500），37℃孵育1 h，TBST洗涤3次（15 min/次），DAB染色，适时终止.1.2.4ELISA法检测IL8和TGFβ1的含量取4个时相点的右肺匀浆离心后的上清液为待测样品. 严格按试剂盒说明书操作. 在450 nm波长处测定A值，根据吸光度在标准曲线中换算样品中IL8和TGF β1的含量.
　　统计学处理：计量资料以x±s表示，采用统计软件SPSS 11.0进行分析，组间比较用非参数秩和检验， P&<0.01为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 Western Blot检测
　　p38MAPK的表达72 h后，空气对照组未见p38MAPK表达，高氧肺损伤组可见p38MAPK表达；高氧肺损伤+生理盐水组p38MAPK表达明显强于高氧肺损伤+SB203580组（图 1）.
　　2.2 ELISA法检测IL8和TGFβ1的表达
　　在高氧肺损伤组和高氧肺损伤＋生理盐水组中，肺组织IL8和TGFβ1浓度均随时间延长呈持续上升趋势；在各个时相点，高氧肺损伤组和高氧肺损伤＋生理盐水组IL8和TGFβ1浓度均高于空气对照组和高氧肺损伤＋SB203580组（P&<0.01，表1）.表1不同处理组新生大鼠右肺IL8和TGFβ1含量测定（略）
　　3 讨论

　　p38MAPK通路是1993年发现的一类MAPK通路. 1994年，Han等［2］首先在小鼠肝脏细胞中克隆了p38MAPK基因，同时发现其在小鼠巨噬细胞和淋巴细胞中均有表达. 和其它MAPK通路一样，p38MAPK通路亦采用磷酸化高度保守的三级激酶级联传递信号，即MEKK5→MKK3/6→p38MAPK［3］. p38MAPK通常由紫外线、内毒素、脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）、高渗环境等激活，之后移位至细胞核内，作用于相应的转录因子，启动某些基因转录. 除了在细胞应激、发育、分化和凋亡中具有重要作用外，p38MAPK在炎症反应中也发挥了重要作用［4］. 在哺乳动物中， p38MAPK特异性抑制剂SB203580对炎症的抑制作用，已经得到证实［5-6］， 并发现了一些不良反应和肝毒性作用.
　　
　　IL8亦称中性粒细胞趋化和激活蛋白1（NAP1），主要由单核巨噬细胞产生，在肺部，还可由中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等产生. LPS，TNFα和IL1β等是IL8分泌的诱导剂. 在高氧肺损伤的急性炎症期，肺泡巨噬细胞等分泌的TNFα，IL1β，IL8和IL6明显增加；随着高氧时间的暴露，TNFα，IL1β和IL6的表达逐渐下降，但IL8仍然处于高水平. IL8是具有强活性的中性粒细胞趋化因子，它可以导致中性粒细胞的大量激活、迁徙并聚集于肺部，在高氧肺损伤中起着极为重要的作用［7］. 体外研究表明，IL8呈剂量依赖性的刺激中性粒细胞脱颗粒，引起呼吸爆发，产生活性氧、弹性蛋白酶及其它中性蛋白酶，并能激活花生四烯酸5脱氧化酶，产生白三烯，使血管通透性增加，血浆蛋白渗出，引起局部损伤［8］.
　　 TGFβ是一类重要的生长调节因子，在组织发生、发展及损伤后修复的过程中具有重要作用. 在哺乳动物中，TGFβ有三个亚型：TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3. TGFβ在体内是以无活性的390个氨基酸二聚前体的形式产生的，然后去掉氨基末端潜在相关肽段而转变成为有活性的112个氨基酸二聚体. 党润等［9］的研究表明，活化TGFβ的过度表达参与了高氧肺损伤的发病过程，且不同亚型的TGFβ在肺组织内的分布和变化趋势也有所不同. 在此过程中，TGFβ和血小板源性生长因子，IL6，基质金属蛋白酶，TNFα等相互影响，发挥着重要的调控作用.
　　 鉴于IL8和TGFβ1在高氧肺损伤中的重要作用，在既往研究的基础上，本研究我们以SB203580处理高氧肺损伤的大鼠模型，结果发现IL8和TGFβ1的表达量明显下降. 不仅再次证实了p38MAPK在高氧肺损伤中具有重要的作用，并发现SB203580能够通过抑制IL8和TGFβ1的分泌或表达来发挥保护作用. SB203580的直接靶点是p38MAPK，但是可能通过某种信号转导途径来达到抑制肺泡巨噬细胞和中性粒细胞分泌IL8，以及抑制肺组织中TGFβ1的活性或者表达的效果. 目前已有很多关于针对IL8和TGFβ1为靶点的治疗药物，若能将其与SB203580联合应用，可能为临床预防和治疗高氧肺损伤提供新的途径.
【参考文献】
　　［1］罗莉漫，李华强，余健. 新生鼠高氧肺损伤中p38MAPK的磷酸化［J］.第三军医大学学报，2006，28(23):2377-2379.

　　［2］Han J， Lee JD， Bibbs L， et al. A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］. Science， 1994， 265(5173): 808-811.

　　［3］Zarubin T， Han J. Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway［J］. Cell Res， 2005， 15(1): 11-18.

　　［4］Schieven GL. The biology of p38 kinase: A central role in inflammation［J］. Curr Top Med Chem， 2005， 5(10): 921-928.

　　［5］Kaminska B. MAPK signalling pathways as molecular targets for antiinflammatory therapyfrom molecular mechanisms to therapeutic benefits［J］. Biochim Biophys Acta， 2005，1754(12): 253-262.

　　［6］Peifer C， Wagner G， Laufer S. New approaches to the treatment of inflammatory disorders small molecule inhibitors of p38 MAP kinase［J］. Curr Top Med Chem， 2006， 6(2): 113-149.

　　［7］Bhandari V. Developmental differences in the role of interleukins in hyperoxic lung injury in animal models［J］. Front Biosci，2002，7: 1624-1633.

　　［8］夏世文， 常立文. 白介素8与高氧肺损伤［J］. 中国实用儿科杂志， 2002， 17(4): 237-239.

　　［9］党润， 许峰. TGFβ在高氧性肺损伤纤维化中的研究进展［J］. 国外医学儿科学分册， 2003， 30(4): 210-213.