关于氩氦刀对T739小鼠LA795皮下移植瘤坏死及细胞凋亡的影响

　　　　　　　　 作者：温居一，段蕴铀，邹曰坤，冯华松，聂舟山

【摘要】 　　目的：研究氩氦刀冷冻消融对T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤坏死和细胞凋亡的影响. 评价氩氦刀冷冻治疗非小细胞肺癌的可行性及疗效. 方法：建立T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤动物模型. 氩氦刀冷冻后，光学显微镜观察冷冻坏死消融规律；末端标记法(TUNEL)原位检测周边冷冻损伤区带细胞凋亡，免疫组织化学法检查Bc12和Bax表达；Western Blot检测冰球周边冷冻损伤区Caspase3表达及聚腺苷二磷酸核苷聚合酶（PARP）剪切活性. 结果：在冷冻中心区，细胞死亡以坏死为主，坏死呈现“双峰”效应：氩氦刀术后3 h出现第1次坏死高峰，坏死区域面积/肿瘤面积达（47±5.51）％；术后4 d出现第2次坏死峰，坏死区域面积/肿瘤面积达（68±4.69）％. 在周边冷冻损伤区，光镜形态学检查及TUNEL染色可观察到明确的细胞凋亡，术后8～16 h凋亡达高峰，凋亡率为（71±6.41）％. 免疫组化显示，Bcl2蛋白表达在冷冻前后无明显变化，bax蛋白在冷冻后其表达上调. Western Blot结果显示：冷冻后冰球周边损伤区带Caspase3和PARP剪切、激活. 结论：氩氦刀通过坏死和凋亡两种途径达到有效的消融. 冷冻消融可能通过Caspase途径诱导周边损伤区带细胞凋亡. 其凋亡机制有Bax蛋白参与，而与Bcl2无关.
【关键词】 Endocare氩氦刀；冷冻消融；腺癌；凋亡
　　【Abstract】 AIM: To study the effect of ArgonHelium cryoablation on necrosis and apoptosis of subcutaneously transplanted tumor of the lung adenocarcinoma LA795 in T739 mice in vivo， thus to evaluate the feasibilty and therapeutic efficacy of argonhelium cryoablation in treatment of Nonsmall cell lung cancer (NSCLC). METHODS: Animal model of subcutaneously transplanted tumor of the lung adenocarcinoma LA795 in T739 mice was establishd. After argonhelium cryoablation， necrosis and ablation laws were studied under light microscope. Cell apoptosis in peripheral cryoablation zone was detected by insitu end labeling (TUNEL). Bc12 and Bax expression were detected by immunohistochemical SABC procedures. The cleavage and activation of Caspase 3 and PARP in peripheral cryoablation zone was detected by Western Blot. RESULTS: In central area of cryoablation， necrosis dominated in cell death， showing double peak efficacy. The first necrosis peak occurred at 3 h after argonhelium cryoablation (area of necrotic area/area of tumor=47％); the 2nd necrosis peak occurred at 4 days after cryoablation (area of necrotic area/area of tumor=68％). In peripheral cryoablation zone， definite cell apoptosis was observed by morphological examination under light microscope and TUNEL staining， and it reached the peak at 8-16 h after cryoablation. Immunohistochemical results showed no obvious change in Bcl2 protein expression before and after cryoablation. Bax protein expression was upregulated after cryoablation. Western Blot results showed cleavage and activation of Caspase3 and PARP in peripheral cryoablation zone around ice ball after the treatment. CONCLUSION: ArgonHeliumbased cryoablation is an efficient technique to induce cell death either by necrosis or by apoptosis. Cryoablation might induce cell apoptosis in peripheral cryoablation zone through Caspase pathway. Bax protein may be involved in apoptosis mechanism， but it is irrelevant to Bcl2.
　　【Keywords】 Endocare CryocareTM surgery system (ArgonHeliumbased); cryoablation; adenocarcinoma; apoptosis
　　0 引言
　　近年来氩氦靶向冷冻治疗，因具有安全、有效、微创、副作用小等特点，已成为一种令人关注的肿瘤微创治疗技术. 目前已经应用于前列腺癌、肺癌、肝癌等多种实体瘤的治疗［1］，其疗效也已得到初步证实. 有关资料显示，目前该研究大多集中在体外细胞学试验［2-3］，有关氩氦刀冷冻消融治疗对活体肺癌组织、细胞的坏死、凋亡有何影响的研究报道较少. 我们建立T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤动物模型，通过实验观察氩氦刀冷冻消融治疗对肺腺癌组织坏死和细胞凋亡的影响，旨在进一步探讨氩氦刀冷冻消融治疗后肺癌组织的超微结构改变及可能的细胞生物学变化，为临床应用提供理论依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　6周龄健康T739小鼠48只，雌雄各半，体质量（20±2.05） g （中国协和医科大学动物研究所）； 小鼠肺腺癌LA795细胞株（协和医科大学肿瘤研究所）；氩氦刀冷冻治疗系统及2 mm冷冻刀头（美国Endocare公司）；TUNEL原位免疫组化试剂盒（美国Roche公司）；Bax及Bcl2免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；leica Qwin图像分析系统（德国徕卡公司）；DNALadder Marker（华美生物工程公司）；聚丙酰胺电泳凝胶电泳系统及半干式电泳转移仪（美国BioRAD公司）；抗PARP抗体，4338MC50（美国Santa cruz公司）；Caspase3抗体（加拿大真达公司），其余相关试剂均为国产或进口分装分析纯级产品.
　　1.2 方法
　　1.2.1 T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤动物模型的建立
　　LA795肺腺癌细胞培养至对数期，取LA795腺癌细胞悬液0.2 mL， 调节细胞数目， 按2.5×106/只接种于小鼠右腿背侧皮下. 2 wk后游标卡尺测量肿瘤长径（25.64 ±1.98） mm， 短径（23.41±1.45）mm. 开始实验.
　　1.2.2 试验分组
　　将小鼠分为对照组和冷冻组，每组24只（雌雄各半）. 冷冻组24只小鼠用速眠新Ⅱ注射液0.2 mL/kg麻醉，固定后，备皮，消毒，2 mm氩氦刀冷冻刀头插入肿瘤中央. 采用双循环冷冻方法：温度降低至-120℃冷冻10 s，复温至0℃，重复上述冻融循环. 冰球平均长径： （23.50±1.06） mm， 短径（18.04±0.96）mm. 对照组不进行冷冻手术，正常喂饲. 两组分别于术后3，5，8，16，24 h和2，4，8 d同时处死动物，取材. 每组各时间点各处死小鼠3只，尽量完整剥离肿瘤组织.

　　1.2.3 形态学观察
　　将剥离的肿瘤组织用40 g/L甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察.
　　1.2.4 TUNEL末端标记法
　　原位检测冷冻损伤区细胞凋亡方法参照TUNEL试剂盒说明书步骤进行. 结果判定：细胞核呈棕黄色颗粒者定义为阳性细胞. 400倍下视野随机计数5个不重复视野的阳性细胞数，每个时间点3只小鼠，取平均值计算凋亡细胞阳性率.
　　1.2.5 免疫组织化学SABC法
　　检查冷冻损伤区Bcl2和Bax表达标本于40 g/L多聚甲醛中浸泡固定24 h，常规石蜡包埋，切片. 步骤按说明书方法进行. PBS替代一抗作阴性对照. 结果判断：Bc12和Bax染色均以胞质出现棕黄色颗粒定义为阳性细胞. 每张切片随机观察5个高倍视野，应用leica Qwin图像分析系统进行处理，随机选场，自动采点分析，测得阳性细胞积分吸光度值. 分析比较Bc12与Bax表达量的变化（积分吸光度值越高，表示阳性细胞区域越大或信号越强）.
　　1.2.6 Western Blot检测
　　冰球周边冷冻损伤区Caspase3表达及PARP剪切活性分别提取冷冻组周边冷冻损伤区和对照组同部位组织，按文献［2］的方法提取蛋白，上样. 按文献［3］的方法走电泳，电转移. 蛋白质转移到硝酸维维膜上后，用1×PBS，50 mg/L脱脂奶粉， 1 g/L Tween20 18℃~24℃微振荡下封闭1 h. 用1×PBS，50 mg/L脱脂奶粉，1 g/L Tween20稀释的1∶2000抗聚腺苷二磷酸核苷聚合酶（polyADPribose polymerase，PARP）抗体和Caspase3抗体，4℃过夜. 1×PBS，1 g/L Tween20洗膜3次. 加入1∶300封闭液稀释的HRP标记的二抗18℃~24℃ 1 h. 1×PBS，1 g/L Tween20洗膜3次. 最后用ECL发光试剂盒显色，观察结果.
　　统计学处理：使用SPSS 11.0统计软件. 采用KaplanMeier生存分析；率的比较使用χ2检验；计量资料的均数比较使用t检验. P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 氩氦刀术后不同时间病灶消融坏死率氩氦刀冷冻消融治疗T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤，冷冻后病灶局部可见三个比较明显的分区（图1A）：冷冻区中心（围绕氩氦刀探头插入处）细胞完全坏死崩解，核碎裂，呈凝固性坏死；坏死区域周边出现明显的损伤区带，其中仍可见部分癌细胞，但细胞皱缩，核浓集，染色质固缩，呈典型的凋亡细胞特征. 局部血管充血、栓塞、渗出（图1B）；外围则是未受损的肿瘤细胞，形态正常. 冷冻组坏死区域面积/肿瘤面积比值远远大于对照组（P&<0.01）. 坏死呈现“双峰”效应：氩氦刀冷冻消融术后3 h出现第1次坏死高峰，坏死区域面积/肿瘤面积达（47±5.51）％； 术后4 d出现第2次坏死峰， 坏死区域面积/肿瘤面积达（68±4.69）％.
　　2.2 TUNEL末端标记法原位检测
　　细胞凋亡 对T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤实施局部冷冻后， TUNEL染色结果显示，凋亡细胞主要集中分布在冰球周围损伤区带，细胞出现了凋亡特有的形态学变化：表现为细胞核着棕黄色，核固缩，染色质靠核膜周边呈蚕豆或新月形浓染（图2），对照组肿瘤组织中少量凋亡细胞散在分布. 与对照组相比，冷冻组各时间点凋亡细胞阳性率均显著高于对照组（P&<0.05）. 冷冻组凋亡细胞于术后3 h即开始增多，术后8～16 h凋亡达高峰（71±6.41）％.
　　2.3 Bcl2和Bax蛋白表达
　　光镜观察可见Bcl2主要位于胞浆内，呈棕黄色，散在或灶状分布. 冷冻坏死区中心几乎未见Bcl2表达. 冷冻组各时间点组周边损伤区与对照组相比Bc12蛋白的表达稍下降，但其差异无统计学意义（P&>0.05）. Bax亦位于胞浆，呈棕黄色. 冷冻消融治疗后在冷冻灶周边损伤区Bax表达增多，染色也较深. 对照组Bax呈散在分布. Bax在冷冻后表达明显上调（P&<0.01，图3，表1），其分布与TUNEL染色结果大体一致.表1Bax和Bcl2免疫组化染色积分吸光度值(略)
　　2.4 Western Blot检测
　　冰球周边冷冻损伤区Caspase3及PARP剪切活性实验结果表明冷冻后冰球周边损伤区组织PARP蛋白从一条完整的Mr约为116 ku剪切为85 ku，而对照组相同部位取材则未见PARP剪切；冷冻组Caspase3由Mr约为32 ku剪切为20 ku，而对照组则未见剪切片断（图4）.
　　3 讨论
　　氩氦刀是局部破坏肿瘤的一个有效手段［4］. 治疗时， 氩氦刀冷冻冰球中心的温度可达-125℃左右，可致细胞完全坏死消融. 但随着距探头中心距离的增加，温度逐渐回升［5］，冰球周围癌细胞并未坏死，而表现为一个冷冻损伤区带. 研究氩氦刀对该区域组织细胞的影响，对于手术靶区设计及解决术后残留问题，具有重要的临床意义.
　　我们的研究结果显示，T739小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤经氩氦刀冷冻消融后，组织坏死呈“双峰”效应，冷冻术后4 d出现第2次坏死高峰. 并且在冷冻后相当长的时间内，冷冻损伤区带细胞仍存在较高的凋亡率. 这与国外液氮冷冻的试验结果一致［6-7］. 提示：由于坏死和低氧血症等共同诱导的继发炎症反应，构成了冷冻术的延迟效应，也可以诱导细胞凋亡，其凋亡机制可能亦参与了冷冻所致的细胞损伤.
　　Bcl2蛋白的过表达可在多种肿瘤中发生［8］，作为一种抑凋亡蛋白已得到普遍认同. Bax与Bc12作用相反，能促进细胞凋亡，但其是否能单独介导凋亡存在争议，肺癌组织存在Bcl2蛋白表达上调和Bax蛋白表达下调［9］. 而冷冻后Bcl2家族蛋白表达则是细胞特异性的［10］. 本试验结果显示，冷冻后Bc12蛋白的表达未见明显变化，这与文献报道的基本一致［10］， 提示冷冻诱导肺癌凋亡的途径可能不是通过调节Bcl2来实现的. 我们同时观察到，Bax在冷冻后表达上调，在组织中的分布与TUNEL染色结果类似，说明Bax在冷冻促进凋亡的过程中显示了作用.
　　有研究证实，Caspase蛋白水解PARP是细胞凋亡的早期事件. 通过检测PARP剪切片断，证实细胞凋亡事件发生［3，11-12］. 本实验结果表明在冷冻后冰球周边损伤区带组织可观察到Caspase3和PARP蛋白剪切，表明冷冻治疗可能通过Caspase途径诱导冰球周边损伤区带细胞凋亡. 这提示我们在氩氦冷冻消融治疗后，有必要联合放、化疗等治疗手段，以进一步促进冷冻周边损伤区带细胞凋亡，进而提高冷冻治疗的效果.