关于前列腺酸性磷酸酶在非前列腺腺癌中的表达

　　　　　　　　作者：王毅，王芳，宿晓云，原田守，山田亮，伊东恭悟，颜炜群

【摘要】 　　目的： 探讨前列腺相关抗原前列腺酸性磷酸酶（PAP）在非前列腺癌中的表达水平. 方法： 分别用RTPCR方法和Western Blot方法检测多种腺癌细胞系中PAP mRNA和PAP蛋白的表达水平；用免疫组织化学方法检测多种腺癌肿瘤组织中的PAP蛋白的表达水平. 结果： 3种结肠癌细胞（colo 201， colo 205和colo 320）、3种胃癌细胞（MKN7， MKN28和 MKN45）和7种乳腺癌细胞（OCUBF， OCUBM， R27， MCF7， CRL1500， YMB1E和MDAMB231）表达PAP mRNA和PAP蛋白，结肠癌、胃癌和乳腺癌肿瘤组织中PAP呈阳性表达. 在检测的5种肾细胞癌细胞和肾细胞癌组织中均未发现有PAP的表达. 结论： PAP是结肠癌、胃癌和乳腺癌的新靶点.
【关键词】 酸性磷酸酶；前列腺；腺癌
　　【Abstract】 AIM: To study the expression of prostatic acid phosphatase (PAP) ，a prostaterelated antigen， in nonprostate cancer cells or tissues. METHODS: A variety of adenocarcinoma cell lines were examined for their PAP expression at the mRNA and protein levels by RTPCR and Western Blot analysis， respectively. The PAP expression in cancer tissues was also examined by immunohistochemical staining. RESULTS: Three kinds of colon cancer cells(colo 201， colo 205 and colo 320)， 3 kinds of gastric cancer cells (MKN7， MKN28 and MKN45)， and 7 kinds of breast cancer cell lines (OCUBF， OCUBM，R27， MCF7， CRL1500， YMB1E and MDAMB231) as well as cancer tissues were found to be positive for PAP at both the mRNA and protein levels. But is was not found in 5 kinds of kidney cancer cells or tissues. CONCLUSION: PAP is a new target of nonprostate adenocarcinomas， including colon， breast and gastric cancers.
　　【Keywords】 acid phosphatase; prostate; adenocarcinoma
　　引言
　　前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase， PAP）最早发现于1938年［1］，之后它便作为前列腺癌肿瘤标志物. 与Gleason score 和前列腺特异性抗原（PSA）相比， PAP能够更精确指示肿瘤的微转移［2］. 此外，PAP还是转移性非雄性激素依赖性前列腺癌特异性免疫治疗的靶点［3］. 一直以来，PAP的组织分布被认为局限于前列腺以及前列腺肿瘤［4-5］. 然而，有报道指出PAP也表达于非前列腺组织中［6-7］，如小肠癌［8］，胰腺内分泌瘤［8］，膀胱腺癌［9］等. 最近，PAP被认为是血管内大B细胞淋巴瘤（intravascular large Bcell lymphoma）的肿瘤标志物［10］. Inoue等［11］也曾报道了PAP在食道癌和肺鳞片细胞癌细胞中的表达. 本研究拟在此基础上， 进一步探讨PAP在其他腺癌中的表达水平，为非前列腺癌的特异性免疫治疗提供新的靶点.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　结肠癌细胞系(colo 201， colo 205， colo 320， SW 480和SW 620)，胃癌细胞系(MKN7， MKN28， MKN45和KATOIII)， 乳腺癌细胞系(OCUBF， OCUBM， R27， MCF7， CRL1500， YMB1E和MDAMB231)，肾细胞癌细胞系（RC3014， Caki1，VMRCRCW， MAMIYA和KUR11），前列腺癌细胞系LNCaP. RNABee 试剂（TELTEST），RTPCR试剂盒（Takara），Taq DNA 聚合酶 (Promega Corp)，胰蛋白酶抑制剂，苯甲磺酰氟（Sigma），PAP抗体(ScyTek Laboratories.)，Western Lightning Chemiluminescence Reagent (Perkin Elmer Life Sciences)，羊抗人PAP抗体，CSA SYSTEM KIT试剂盒（DAKO）.
　　1.2 方法

　　1.2.1 RNA提取及RTPCR按照RNABee说明书提取处于对数生长期细胞的总RNA，其中5 μg 总RNA用于cDNA 的合成. 用于PAP表达检测的PAP特异性引物为: 上游引物: 5′CTC CTC AAC ATG AGA GCT GC3′， 下游引物：5′TAT ATA CTC TCC AAG TTC ATA3′. 利用Taq DNA 聚合酶进行PCR反应，共30个循环（95℃ 1 min， 60℃ 1 min， 72℃ 1 min）. PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶上进行检测.
　　1.2.2 Western Blot各肿瘤细胞系中PAP蛋白的表达用Western Blot 检测. 收集处于对数生长期的细胞，经PBS清洗弃去培养液后，置于缓冲液中进行裂解. 缓冲液成分：10 mmol/L TrisHCl (pH 7.4)，150 mmol/L NaCl， 5 mL/L Triton X100，0.2 mmol/L 苯甲磺酰氟，30 U/L胰蛋白酶抑制剂. 置于冰上30 min. 然后在4℃，25 000 g条件下离心20 min，收集上清液于-80℃保存. 利用SDSPAGE电泳对上清液进行分离，凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上. 在室温用30 g/L 牛血清白蛋白(BSA)封闭PVDF膜1 h后，先后与鼠抗人PAP抗体、辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗鼠抗体孵育，最后用Western Lightning Chemiluminescence 试剂进行显色. 前列腺癌细胞LNCaP 和健康人外周血单核细胞（PBMCs）分别作为阳性和阴性对照.
　　1.2.3 免疫组化甲醛固定、石腊包埋的病理切片经脱石腊后，置于含30 mL /L h3O2的甲醇溶液中来封闭内源性过氧化物酶活性，然后在加入第一抗体之前，用血清进行孵育以减少非特性染色. 按照说明书，利用CSA SYSTEM KIT试剂盒和羊抗人PAP抗体进行免疫组织化学检测.
　　2 结果
　　2.1 PAP mRNA 在非前列腺腺癌细胞中的表达在所检测的5种结肠癌、4种胃癌、7种乳腺癌和5种肾癌细胞中，3种结肠癌细胞（colo 201， colo 205和colo 320)、3种胃癌细胞(MKN7， MKN28和MKN45)以及所有的7种乳腺癌细胞中(OCUBF， OCUBM， R27， MCF7， CRL1500， YMB1E和MDAMB231)检测到PAP mRNA的表达；而在5种肾癌细胞中均未检测到PAP mRNA的表达（图1）.
　　2.2 PAP蛋白在非前列腺癌细胞中的表达在3种结肠癌细胞(colo 201， colo 205和colo 320)、2种胃癌细胞 (MKN28 和MKN45) 以及 4种乳腺癌细胞 (OCUBF， OCUBM， CRL1500和MDAMB231)中检测到PAP蛋白的表达. 虽然在PCR结果中检测到MKN7， R27， MCF7和YMB1E 细胞中有PAP mRNA的表达，但是在Western Blot结果中没有发现有PAP蛋白质的表达. 在5种肾癌细胞中均未检测到PAP蛋白质的表达（图2）.
　　2.3 PAP在非前列腺肿瘤组织中的表达结果显示，PAP在所检测的5个结肠癌病理切片中均为阳性表达，7个胃癌病理切片中有5例为PAP阳性，5个乳腺癌病理切片中有2例为PAP阳性. 代表性结果见图3. PAP 蛋白质表达于腺癌细胞的细胞质中.
　　3 讨论
最近的研究揭示一些没有突变的自身抗原，包括：黑色素细胞分化抗原（ melanocyte differentiation antigens）可以作为肿瘤患者特异性免疫治疗的非常有希望的靶点［12］. 其他的一些自身抗原，如 HER/2 neu和p53也都被用做抗肿瘤免疫治疗的靶分子［13］. 和这些靶分子相比，由于前列腺相关抗原的表达一般被认为局限于前列腺和前列腺癌，因此前列腺相关抗原显得更具潜力. PAP 是一种前列腺相关抗原，有报道提示PAP是一种高效的抗肿瘤疫苗［14］.
　　Small等［15］利用负载有PAP和GMCSF重组融合蛋白的自体树状细胞对非荷尔蒙依赖性前列腺癌患者进行了一期临床试验，结果表明这种以PAP为靶点的特异性免疫治疗是安全的，疾病进展所需的时间与抗PAP免疫应答的产生密切相关. 其他研究报道利用具有HLAA2结合位点的PAP多肽对男性健康人的PBMCs进行体外刺激，可以诱导出PAP多肽特异性CTLs，这些PAP多肽特异性CTLs对前列腺肿瘤细胞具有细胞毒性［16］. 我们也曾经报道过PAP 213221 多肽对于HLAA24+前列腺癌患者具有免疫原性，并可以从他们的PMBCs中诱导出杀伤前列腺肿瘤细胞的CTLs［11］. 这些证据表明，虽然PAP是一个无突变的自身抗原，但是PAP可以被宿主的免疫系统所识别，因此可以作为特异性免疫治疗的靶分子.

　　我们曾经发现在食道癌和肺鳞状细胞癌的肿瘤细胞中有PAP的表达，并且这些表达PAP的肿瘤细胞能够被PAP 213221 多肽特异性CTL所识别［11］. 同时也有文献报道在胰腺的神经内分泌肿瘤、小肠癌、后肠源性肿瘤和膀胱腺癌中都发现有PAP的表达［8-9，17-18］. 此外，PAP 还被建议作为血管内巨B细胞淋巴细胞瘤的肿瘤标志物［10］. 这些报道提示PAP可能作为非前列腺肿瘤特异性免疫治疗的靶分子. 因此，我们对一些非前列腺腺癌中的PAP表达水平进行检测，结果表明有相当比例的腺癌细胞以及腺癌组织都为PAP阳性. RTPCR结果显示结肠癌、胃癌和乳腺癌细胞中有PAP mRNA 的表达； Western Blot结果表明结肠癌、胃癌和乳腺癌细胞中有PAP蛋白的表达；此外，在结肠癌、胃癌和乳腺癌切片中也观测到PAP阳性染色. 这一系列证据表明PAP不仅可以作为前列腺癌，还可以作为其他一些腺癌的主动免疫治疗的靶点.
【

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