关于他克莫斯对树突状细胞分化、成熟和功能的影响

　　　　　　　　　　 作者：郑凯 谭建明 吴卫真 杨顺良 徐廷昭

【摘要】 目的：探讨他克莫斯（tacrolimus， FK506）对大鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)分化、成熟和免疫学活性的影响. 方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同浓度的FK506进行培养，采用流式细胞术行DCs表型分析，ELISA法检测培养上清中IL12 的水平并行体外混合淋巴细胞反应（MLR），观察DCs对同种T细胞的刺激能力. 构建大鼠肾移植模型，于移植前7 d输注FK506处理的DCs，观察移植肾存活时间. 采用ELISA法检测MLR培养上清和移植大鼠血清中TH1/Th3细胞因子IFNγ，IL2，IL4 和IL10的表达水平. 结果：FK506对DCs表面分子(Iad，CD80和CD86)的表达无明显影响(P&>0.05)，而IL12的分泌水平降低(P&<0.05)，并显著抑制DCs对T细胞的激活能力(P&<0.05). 大鼠移植肾存活时间分别为对照组(6.3±0.7) d，DCs组(7.2±1.4) d与FK506DCs组(19.0±2.3) d，对照组与DCs组之间差异无统计学意义，而FK506DCs组与DCs组之间差异有统计学意义(P&<0.05). 在体外MLR和动物实验中，FK506DCs组与DCs组比较，IL2，IFNγ表达水平均显著降低( P&<0.05)，IL4表达水平显著升高(P&<0.05)，而IL10的表达水平在体外显著升高(P&<0.05)，但在动物实验中与DCs组差异无统计学意义(P&>0.05). 结论：FK506不影响DCs的分化与成熟，对其免疫学功能起负性调节作用. 可能机制为FK506通过抑制DCs IL12的分泌，来促使Th1/Th3亚群分化倾向于Th3方向.
【关键词】 他克莫斯; 树突状细胞; 免疫耐受; 器官移植
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of tacrolimus (FK506) on the differentiation， maturation and function of rat bone marrowderived dendritic cells (DCs). METHODS: We added tacrolimus at concentrations of 5-20 μg/L to the DCs culture and checked the expressions of activation markers (Iad， CD80 and CD86) by flow cytometry， the release of cytokines IL12 by ELISA and the stimulatory capacity of the resulted DCs by mixed lymphocyte reaction (MLR). Thirty Wistar rats were pided into 3 groups (n=10 in each): group A accepted kidneys from SD donors; group B was infused with DCs derived from SD donors 7 d before transplantation; group C was the same as that in group B except the DCs were treated with tacrolimus during culture. The functions of the transplanted kidneys were evaluated by urine volume and ELISA was used to detect the levels of Th1/Th3 cytokines， such as IFNγ， IL2， IL4 and IL10 in the MLR and in the sera of the recipients 7 d after culture or transplantation. RESULTS: Even at the stimulation of lipopolysaicharide (LPS)， in the tacrolimustreated culture， we observed no significant effects on the expressions of activation markers (Iad， CD80 or CD86). The release of IL12 and the stimulatory capacity of tacrolimustreated DCs were reduced， compared with control DCs (P&<0.05). The survival time in the group A， B and C was （6.3 ±0.7） d， （7.2±1.4） d and （19.0±2.3） d， respectively. Statistical analysis showed that the survival time of group C was significantly increased compared with that in group B (P&<0.05)， but there was no significant difference between group B and A (P&>0.05). The levels of IFNγ and IL2 in group C were significantly lower than those in group B (P&<0.05)， and the level of IL4 in group C was significantly higher than that in group B (P&<0.05). The level of IL10 in group C was significantly higher than that in group B (P&<0.05) in vitro， but similar in vivo (P&>0.05). The levels of cytokines had no significant different between group B and A (P&>0.05). CONCLUSION: Tacrolimus does not interfere with the differentiation or maturation of DCs， but reduce the ability of stimulating T cells. The mechanism may be related to the decrease of Th1/Th3 ratio by impairing the production of DCsderived IL12.
　　【Keywords】 tacrolimus; dendritic cells; immune tolerance; organ transplantation
　　0引言
　　树突状细胞(dendritic cells， DCs)是专职性抗原递呈细胞(antigenpresent cell，APC)，它与效应T 细胞的相互作用决定着免疫应答的发生(激活/耐受)及强度. 近年来，DCs在移植免疫耐受诱导、自身免疫性疾病和变态反应性疾病的治疗等方面展现出独特的应用价值［1］. 我们观察了他克莫斯（tacrolimus， FK506）对骨髓源性DCs成熟与免疫功能的影响，初步探讨FK506在免疫应答早期抗原提呈过程中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　健康雄性Winstar大鼠和SD大鼠，体质量250～350 g（上海斯莱克公司），在无特定病原体(specific pathogenfree， SPF)环境中饲养. FK506（日本藤泽制药公司）；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rGMCSF)与外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI 1640培养基及胎牛血清（Gibco公司）；PE标记的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86 mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2， IFNγ的ELISA试剂盒（Bender公司）；3HTdR（Amersham Life Science公司）. EpicXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司).
　　1.2方法
　　1.2.1骨髓来源DCs的提取与鉴定参照文献［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，冲洗出骨髓细胞，以1∶10的体积比加入37℃预温的TrisNH4Cl去除红细胞；加GNK缓冲液终止反应，离心洗涤2次；用RPMI 1640调细胞密度为1×109/L，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养2 h；轻轻洗去非粘附细胞；在贴壁细胞中加入含10 μg/L rrIL4和10 μg/L rrGMCSF的RPMI 1640完全培养基，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养6～7 d，收集生长状态良好的DCs备用.
　　1.2.2DCs表型与分泌IL12水平分析将DCs分成4组，每组设3复孔：① 对照组(DCs组)；② FK506处理组(FK506DCs组)：培养液中加入不同浓度FK506（5， 10， 20 μg/L）；③ 脂多糖刺激组(LPSDCs组)：在培养结束前18 h加入100 μg/L LPS；④ FK506处理+脂多糖刺激组(FK506LPSDCs组). 在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养7 d，收集培养上清液，ELISA方法检测IL12水平（按试剂盒说明书进行）. 收获细胞（2×109/L）；分别加入PE标记的抗Iad， 抗CD80或抗CD86 mAb(终浓度5 mg/L)，4℃作用45 min；流式细胞仪分析，以中位荧光强度（MFI）作为检测指标.
　　1.2.3体外混合淋巴细胞反应(MLR)分析取Winstar大鼠（受者）脾脏，制备无菌脾细胞悬液；过尼龙毛柱获取非粘附的T 淋巴细胞作为反应细胞，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养1 h，调细胞密度为1×109/ L. 以25 mg/L丝裂霉素灭活SD大鼠DCs（DCs；LPSDCs；FK506DCs）作为刺激细胞( 2×108/L)，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养30 min；刺激细胞/应答细胞( S/E) 以不同浓度比(1∶5， 1∶10， 1∶20)加入96孔细胞培养板中，总反应体积为200 μL，含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养72 h；于培养结束前18 h每孔加入3HTdR 3.7×104 Bq；β计数仪测量待测细胞的3HTdR掺入值(cpm).
　　1.2.4大鼠肾移植模型的建立与分组以SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体，参照文献［3］加以改进，采用肾动脉与腹主动脉端侧吻合、肾静脉cuff套管法吻合、供体膀胱瓣与受体膀胱吻合. 将受者Wistar大鼠分为3组，每组10只.① 对照组(A组)；② DCs 组(B组)：肾移植术前7 d自大鼠尾静脉注入DCs 细胞悬液0.5 mL (4×109/L)；③ FK506DCs 组(C组)：肾移植术前7 d注入FK506DCs细胞悬液0.5 mL (4×109/L). 术后于代谢笼内培养，观察大鼠移植肾存活情况，出现无尿即认为移植肾脏失功能.
　　1.2.5Th1/Th3细胞因子测定在体外MLR中，加入3HTdR前收集培养上清；动物实验中，移植7 d后抽取受鼠尾静脉血并分离血清，ELISA试剂盒说明书分别检测IFNγ， IL2， IL4和IL10 水平.
　　统计学处理： 应用SPSS 10.0软件包进行数据处理， 两组间比较采用随机分组t检验方法， 多组间比较采用单因素方差分析方法， 以P&<0.05为判定标准.
　　2结果
　　2.1DCs表型分析FK506DCs组Iad，CD80和CD86的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P&>0.05). LPS刺激后，Iad，CD80和CD86的表达显著增加，与未处理组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，但FK506对其无明显影响，LPS DCs组与FK506 LPS DCs组比较差异无统计学意义(P&>0.05，表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)对DC表面分子表达的影响 (略)
　　2.2DCs分泌细胞因子IL12检测在DCs培养的第7日，FK506DCs组培养上清中的IL12水平分别为: 5 μg/L组(105.0±9.5) ng/L；10 μg/L组（74.4±6.6） ng/L； 20 μg/L组（41.7±3.9） ng/L. 明显低于DCs组的(176.8±19.7) ng/L (P&<0.05)；并表现为剂量依赖性. 不同浓度FK506组间差异有统计学意义(P&<0.05). 加入脂多糖后，LPSDCs组的IL12分泌明显增加［(396±35) ng/L］，与DCs组比较有统计学意义(P&<0.05)；而FK506LPSDCs组的IL12水平［5 μg/L 组（112±11）ng/L；10 μg/L 组（92±10） ng/L；20 μg/L 组（ 49±7）ng/L］未见明显增加，与FK506DCs组比较差异无统计学意义(P&>0.05).
　　2.3DCs对同种T 细胞MLR检测LPS刺激活化的DCs可以诱导T细胞活化，FK506处理的DCs促进T细胞增殖的能力明显受到抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05)，表现为剂量依赖性，不同浓度FK506组间差异有统计学意义(P&<0.05，图1）. 在选取的浓度范围内未观察到FK506的细胞毒性，DCs与T细胞的最佳浓度梯度为1∶10，继续增加浓度并不能提高激活能力.
　　2.4移植物的存活时间对照组移植肾脏的存活时间(6.3±0.7) d与DCs组 (7.2±1.4) d比较，差异无统计学意义，FK506DCs组移植肾脏的平均存活时间延长至(19.0±2.3) d，同另两组比较差异有统计学意义(P&<0.05，图2）
　　2.5Th1/Th3细胞因子检测在体外MLR（图3）和动物实验（图4）中，FK506处理DCs组与DCs组比较，IL2，IFNγ水平均明显降低(P&<0.05)，IL4水平明显升高(P&<0.05)，而IL10的表达水平在体外明显升高(P&<0.05)，但在大鼠体内与DC组差异无统计学意义. DCs组Th1/Th3细胞因子表达水平与对照组差异无统计学意义.

　　3讨论
　　近几年，DCs在移植免疫耐受中的作用逐渐受到重视［1］. DCs是目前发现的功能最强的APCs［4-5］，也是唯一能够激活初始型T 细胞启动初次免疫应答的APCs，调节免疫激活/耐受的平衡［6］. 从上世纪九十年代初开始，FK506作为免疫抑制剂应用于器官移植领域，因为其强效、低毒性等特点，在短短的十几年临床应用过程中，以FK506为基础的免疫抑制方案已经逐步超过以环孢霉素为基础的免疫抑制方案，成为临床器官移植免疫抑制的首选药物. 迄今为止，对FK506免疫抑制效应的理解集中在其对T淋巴细胞的负性调节作用，既抑制T 淋巴细胞的增殖和免疫效应因子如IL2，IFNγ等的分泌. 最近有研究表明［7-9］，FK506也能够影响DCs的成熟和功能，在免疫应答早期既抗原提呈过程中发挥作用.
　　我们用大鼠骨髓造血干细胞成功地诱导出DCs，并在体外观察FK506对DCs细胞表型和刺激T细胞活化增殖能力的影响. 发现FK506并不影响DCs表面共刺激分子CD80，CD86和MHCII类分子Iad的表达，这些分子是DCs成熟的标志. 在实验中加入LPS刺激加速了DCs的成熟过程，而FK506对这一过程同样无抑制作用，提示FK506并不影响DCs的成熟过程. IL12是DCs成熟过程中分泌的一种主要的效应细胞因子，能促进Th0细胞分化为Th1细胞，从而诱导Th1型细胞介导的免疫反应. FK506处理DCs的IL12分泌水平明显降低， 即使加入LPS刺激后IL12的分泌也无明显增加， 提示FK506抑制DCs的抗原提呈功能可能是通过降低IL12的分泌来完成.
　　
　　在体外混合淋巴细胞培养中，FK506处理的供者来源的DCs，可明显抑制T 淋巴细胞的增殖与活化，并呈现为剂量依赖关系. 在大鼠体内实验中，FK506DCs回输给受者后可明显延长移植物存活时间. FK506DCs回输作为一种简单易行的方法，更易于进入移植临床，虽然应用FK506诱导免疫耐受尚有待研究，但至少可以降低移植受者术后免疫抑制剂用量，减少药物的毒副作用. 在体外MLR和动物体内实验中，均发现经FK506处理的DCs可显著降低Th1亚群淋巴细胞分泌的细胞因子水平，而Th3亚群细胞因子的分泌水平显著提高，表明FK506处理的DCs能抑制T淋巴细胞向Th1的分化，并诱导其向Th3分化，这可能是移植物长期存活的主要或至少是相关的重要因素. IL10在体内外表达水平的差异说明体内环境远较体外复杂，这可能是某些效果明显的体外研究，进入临床却不尽人意的原因之一. 在临床实践中，部分器官移植受者在因为各种原因的免疫抑制剂裁撤过程中表现出特异的免疫无反应性，我们推测，FK506对DCs的影响可能在这一现象中发挥作用.
　　
　　总之，探讨FK506对抗原呈递细胞、特别是DCs的作用，必将加深和完善对FK506免疫抑制作用机制的理解，使其更合理的应用于临床，而FK506表现出的诱导免疫耐受的作用也为免疫耐受的诱导方法提供一个全新的切入点.
基金项目：福建省自然科学基金（C0510033）
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