关于褪黑素对大鼠慢性压迫脊髓损伤Caspase3表达及细胞凋亡的影响

　　　　　　　　 作者：潘文杰　汪玉良　王栓科　夏亚一　贺艳　李延宏　王景

【摘要】 目的：探讨褪黑素（MT）对大鼠慢性压迫脊髓损伤半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达和细胞凋亡的影响. 方法：将70只大鼠建立慢性压迫损伤动物模型，随机分为MT治疗组（A 组）和含50 mL/L无水乙醇的生理盐水对照组（B 组），于损伤1，4，11，21，35，60和90 d取材，采用HE染色观察慢性压迫脊髓损伤脊髓组织病理变化，用免疫组化法染色检测Caspase3表达阳性细胞，原位末端标记法（TUNEL法）标记凋亡细胞，并用改良的Tarlov评分法和斜板实验观察大鼠脊髓神经功能变化情况. 结果：ＨＥ染色光镜下观察脊髓组织病理学改变Ａ组明显轻于Ｂ组.Ａ，Ｂ两组均发现Caspase3表达及TUNEL标记阳性凋亡细胞，Caspase3表达和神经细胞凋亡指数均Ｂ组＞Ａ组（P&<０.０５），与大鼠脊髓神经功能变化有平行的变化趋势. 结论：MT能抑制大鼠慢性压迫脊髓损伤Caspase3表达和神经细胞凋亡.
【关键词】 褪黑素;慢性脊髓损伤；细胞凋亡；Caspase3；神经功能
　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of melatonin on expression of caspase3 and apoptosis in chronic compression spinal cord injury in rats. METHODS: The chronic compression spinal cord injury model was established by compression to the posterior spinal cord in 70 healthy male Wister rats， then the rats were randomly pided into 2 groups: treatment group receiving melatonin (group A) and control group receiving physiological saline containing 50 mL/L ethanol (group B). The rats were killed at day 1， 4， 11， 21， 35， 60， 90 after injury， and then the tissue slices of injured spinal cord were cut for morphological studies by HE staining. The expression of caspase3 was detected with immunohistochemistry. TUNEL was used to label apoptotic cells. Neurological function changes were assessed with improved Tarlov scores and inclined plane test. RESULTS: The histopathological changes in injured spinal cord tissue observed with HE staining and microscopic examination in group A was distinctly less than those in group B. Expression of caspase3 and TUNELpositive cells were both seen in the 2 groups， and the expression of caspase3 and apoptosis index in group B was higher than those in group A (P&<0.05)， which was parallel to changing trend of neurological function after chronic compression spinal cord injury. CONCLUSION: Melatonin could suppress caspase3 expression and apoptosis in chronic compression spinal cord injury in rats.
　　【Keywords】 melatonin; chronic spinal cord injury; apoptosis; caspase3; neurological function
　　0引言
　　脊髓损伤一直是世界性重要的医学课题.近年来研究证实了脊髓损伤后存在大量神经细胞以凋亡的形式死亡，可见细胞凋亡是脊髓损伤继发改变的重要病理过程［1-2］.有效抑制神经细胞凋亡已成为脊髓损伤治疗的一个途径.褪黑素（melatonin，MT）是松果体分泌的一种激素，研究发现其具有强大的自由基清除作用，对脑损伤、帕金森病、外周神经损伤等多种神经系统疾病有保护作用［3］，但相关的机制却少见报道.本实验用大鼠慢性压迫脊髓损伤模型，腹腔注射MT，通过观察其对细胞凋亡和半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase3）表达的影响，进一步探讨MT保护神经细胞的作用机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　220～280 g健康成年雄性Wister大鼠70只（由兰州军区总医院实验动物中心提供）；MT(美国Sigma公司)，用无水乙醇溶解， 生理盐水稀释， 最终乙醇浓度为50 mL/L；兔抗鼠Caspase3 p20亚单位一抗， 原位末端标记（TUENL）试剂盒，SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1动物分组
　　将70只大鼠随机分为脊髓压迫+MT治疗组(A组)和脊髓压迫+含50 mL/L无水乙醇生理盐水对照组(B组)，每组动物35只.
　　1.2.2动物模型建立
　　70只大鼠用100 mL/L水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉，常规消毒铺巾，以椎体T10为中心取后正中切口，明确及咬除T10棘突及部分椎板，置入平头塑料螺钉对大鼠脊髓进行渐进性后路压迫［4］（在螺钉中央钻孔插入细银丝以便于影像学观察），以后每隔10～15 d显露螺钉，将螺钉旋进约0.1～0.25 mm，共5～6次.观察椎管狭窄率（constrictive rate of spinal canal， CR） 即压迫物占椎管矢状径的百分比，同时观察脊髓受伤平面以下的神经功能状况，定期行受压脊柱脊髓影像学检查，直至脊髓受压程度达40%～60%（中度程度压迫）.分别于损伤1，4，11，21，35，60和90 d取材，每组各时相点5只动物.
　　1.2.3给药方法
　　A组: 在暴露的硬膜下注射MT(5 mg/kg)，伤后即刻经腹腔注射MT(10 mg/kg)，之后每日11：00经腹腔注射同等剂量MT 1次. B组: 注射方法同A组，给予等量的含50 mL/L无水乙醇生理盐水作为对照治疗.
　　1.2.4神经功能检查
　　A，B两组各时相点动物处死前分别行改良的Tarlov评分、斜板试验，对大鼠进行行为及肢体运动功能检查，观察慢性压迫脊髓损伤各时相点大鼠后肢活动、肌力等的变化，以此评定MT对大鼠慢性压迫脊髓损伤脊髓神经功能的影响.
　　1.2.5取材及固定
　　将两组大鼠在各相应取材时间点用100 mL/L水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉，经左心室灌注生理盐水200 mL冲洗至流出澄清液，再用40 g/L多聚甲醛约200 mL灌流固定，解剖椎管，以损伤处为中心完整切除约1.5 cm脊髓组织，立即用40 g/L中性甲醛固定72 h后，常规石蜡包埋连续切片，片厚4 μm，以备HE染色和免疫组化染色及TUNEL染色.
　　1.2.6免疫组化染色及TUNEL染色
　　免疫组化染色参照SABC试剂盒说明书进行操作，中性树脂封片保存，镜下观察每张切片的阳性细胞，结果判定：细胞胞质呈棕黄色染色定为阳性细胞，计数高倍视野（×400）内阳性细胞数并计算阳性细胞率；TUNEL法标记，严格按照检测试剂盒说明书对脊髓组织切片进行染色，结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒定为阳性细胞，计算高倍视野（×400）下凋亡细胞指数（apoptotic index， AI），即每张片选取6个阳性细胞最多的高倍视野，计算出平均阳性细胞百分数.
　　统计学处理：数据用x±s来表示， 采用SPSS 10.0软件包进行数据分析，差异统计学意义检验采用t检验， P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1病理组织学改变B组大鼠压迫初期脊髓灰质水肿，点状出血，部分神经元肿胀，尼氏体淡染，消失，有卫星现象，有少量小胶质细胞和星形胶质细胞增生.白质表现为轴突排列紊乱，有不规则的片状脱髓鞘区.压迫2 mo后灰质内神经元普遍肿胀，卫星现象、噬神经元现象非常显著，可见软化灶.白质内脱髓鞘明显增多，空泡化改变，有少许炎性细胞浸润，胶质细胞增生. A组病理改变较B组有所减轻，早期脊髓组织轻度水肿，无明显出血点，神经细胞肿胀不明显，后期神经元、轴突改变亦较轻微，胶质细胞增生明显(图1).
　　2.2Caspase3的表达B组大鼠脊髓损伤4 d时Caspase3表达呈增加趋势，损伤11 d时明显表达，21 d时达高峰，35 d时表达仍较明显，60 d时明显下降，90 d时仍有一定的表达.A组大鼠用MT治疗后，Caspase3表达较B组低，4 d时有表达，11 d时达高峰，以后呈下降趋势.A组与B组Caspase3表达除1 d外，其它时间点差异均有统计学意义（P&<0.05，表1，图2）.表1大鼠慢性压迫脊髓损伤不同时间点Caspase3表达阳性细胞率（略）
　　2.3TUNEL检测凋亡细胞B组大鼠脊髓损伤4 d时在脊髓灰质及白质有标记阳性的凋亡细胞，损伤11 d时凋亡指数明显增加，21 d时达高峰，35 d时仍明显，60 d时凋亡指数明显下降，90 d时仍可见标记的阳性细胞.A组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数较B组低，高峰发生在损伤11 d，以后明显下降.A组与B组神经细胞凋亡指数除1 d外，其它时间点差异均有统计学意义（P&<0.05，表2， 图3).表2大鼠慢性压迫脊髓损伤不同时间点的凋亡细胞率指数（略）
　　2.4神经功能变化慢性压迫脊髓损伤模型制成后脊髓神经功能无明显异常，随着压迫时间延长及程度加重，脊髓神经功能出现不同程度的下降，A组脊髓神经功能明显好于B组，A组与B组比较除1 d外，其它时间点差异均有统计学意义（P&<0.05，表3).表3大鼠慢性压迫脊髓损伤改良 Tarlov 评分和斜板实验（略）
　　3讨论
　　凋亡是一种自然的生理过程.在神经系统的发育过程中对神经细胞的生长、发育、分化及维持细胞的数量和质量、稳定突触联系和神经内环境起着重要作用.研究表明在神经系统损伤和神经系统退行性疾病的过程中也可有凋亡的改变. Liu等［5］研究进一步证明在大鼠的脊髓损伤模型中存在神经细胞和胶质细胞凋亡现象.

　　Caspase是一组与秀丽隐杆线虫CED3同源的执行哺乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族［6］，与凋亡最为密切的蛋白酶.迄今发现有14个家族成员，其中Caspase3是最重要的终末剪切酶.正常情况下， Caspase3蛋白是以酶原的形式合成并存在于机体细胞中，通过蛋白水解去除氨基酸的一段序列而被活化，Caspase3激活后可裂解细胞内固有的和保护性的酶类导致细胞凋亡.本实验表明在慢性压迫脊髓损伤4 d时Caspase3开始表达，11～21 d达到高峰，以后逐渐减少但仍然有一定数量的表达，推测可能随着压迫时间的延长和程度的加重部分细胞以坏死的形式死亡有关.与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠.从Caspase3阳性细胞先后出现的区域上看，与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致.提示Caspase3参与了慢性脊髓损伤细胞凋亡的调节，进一步推测Caspase3表达增加可能在脊髓继发损伤的病理生理发生发展中起重要作用.对Caspase3进行选择性抑制可能成为防治脊髓继发性损伤的有效途径之一.
　　MT具有高度亲脂性及优先在核中积聚的特性，与其他亚细胞结构相比，核中MT浓度更高［7］，因此不仅能保护膜脂质，而且保护蛋白质，核酸及细胞其它成分［8］. MT以电子供体直接清除自由基，同时能够影响氧化和抗氧化有关酶类的活性［9］起到间接抗氧化作用.最近研究MT能够上调Bcl2而抑制细胞色素C的释放及Caspase3的活性减少培养的松果体细胞凋亡［10］.本研究结果显示B组神经细胞凋亡指数及Caspase3表达均于损伤21 d达高峰，35 d开始降低，90 d仍可见阳性染色细胞.而A组神经细胞凋亡指数及Caspase3表达均较B组低，11 d达到高峰，21 d开始降低，与文献报道的结果相一致.HE染色显示A组早期及后期大鼠脊髓组织病理学改变明显较B组轻.这提示MT除了能通过清除自由基和抗氧化，上调Bcl2而抑制细胞色素C的释放等防治继发性脊髓损伤外，还抑制了脊髓损伤后Caspase3的表达，减少细胞凋亡和损伤，从而对神经细胞起到保护作用.
【参考文献】
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　　［3］崔利德，王立轩，李陈莉.褪黑素的抗氧化作用对抗神经损伤的研究进展［J］. 河北医科大学学报，2006， 27(3):218-221.

　　［4］李利军，孙正义，王清华，等. 慢性压迫性脊髓损伤减压后骨骼肌的变化［J］.第四军医大学学报， 2003， 24(4): 345-347.

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　　［9］Cuzzocrea S， Reiter RJ. Pharmacological action of melatonin in shock， inflammation and ischemia/reperfusion injury［J］. European J Pharmacol， 2001， 426(12): 1-10.

　　［10］Yoo YM， Yim SV， Kim SS， et al. Melatonin suppresses NOinduced apoptosis via induction of Bcl2 expression in PGTbeta immortalized pineal cells ［J］. Pineal Res， 2002，33(3):146-150.