关于多巴胺受体D1在小鼠运动调节方面的作用及与帕金森病的关系

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　　　　　　　　 作者：刘丰刀 陈燕 任志华 徐明 陆振虞

【摘要】 　　目的: 探讨多巴胺受体亚型D1在小鼠运动协调中的作用及与帕金森病的关系. 方法：观察WT组（野生型）和D1（-/-）组小鼠的运动协调行为、体质量等表现差异；纹状体部苏木精伊红（HE）石蜡切片的形态学比较；酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化黑质致密部嘴侧1/3～2/3多巴胺能神经元数目比较，以及纹状体部Western Blot蛋白水平检测TH含量变化. 结果：TH免疫组化示两组小鼠黑质致密部嘴侧1/3～2/3区域的阳性多巴胺能神经元数目无明显差异. HE染色示两组小鼠纹状体部形态及其大小无明显差别，但日常行为学观察两组小鼠差异显著（P&<0.01），D1（-/-）组小鼠中脑石蜡切片显示神经元的退行性表现；而WT组未发现典型的神经元退行性改变. Western Blot示WT组与D1（-/-）组小鼠的纹状体部TH表达水平差异显著（P&<0.05）. 结论：多巴胺受体D1在小鼠运动协调方面起重要作用，该受体的缺失对黑质多巴胺能神经元的影响程度虽没临床帕金森病（PD）严重，但仍可加速多巴胺能神经元发生退行性改变.
【关键词】 受体 多巴胺 神经退行性改变 帕金森病
　　 0引言
　　近年来，由于多巴胺受体DA1型和2型及其亚型方面的研究进展［1］，使得从更为精细分子角度阐明其在运动调节方面的机制以及其在帕金森病(PD)发病方面是否相关成为热点［2］. PD典型临床表现为运动减少、骨骼肌张力增高和静止性震颤，源于当黑质致密区多巴胺能神经元变性超过80％以上时，锥体外系运动功能失去自我调控［3］. 随着对PD发病机制的探讨研究，中枢多巴胺能受体成为热点之一，尤其是在D2受体方面已取得很大进展. 我们以多巴胺受体D1为研究目标探讨D1受体在运动调节等方面的作用机制及该机制的紊乱是否与临床PD的发生相关.
　　1材料和方法
　　1.1材料C57BL和129系杂交小鼠（上海交通大学医学院动科部），其中多巴胺受体D1(-/-)小鼠由美国芝加哥大学徐明教授提供［4］. 小鼠饲养传代于SPF级环境下，并定期密切观察两种品系小鼠日常行为表现，传代稳定后选择10 wk龄小鼠用于实验.日常行为观察于上海交通大学医学院动物中心实验室SPF环境下进行，相应仪器设备由该实验室提供. 石蜡切片仪器有“上海南方模式基因中心”提供. TH抗体(兔抗小鼠多克隆抗体)（美国Sigma公司）；生物素化羊抗兔IgG及SABC试剂盒（Santacruz公司）；Western Blot所用材料（Biorad公司）；PVDF膜，Acr/Bis 30%，Temed，SDS，Tris 1.5 mol/L （pH 8.8）， Tris 0.5 mol/L （pH 6.8）均购自Biorad公司.
　　1.2方法
　　1.2.1动物分组、日常行为学观察及体质量指标检测随机挑选同周龄（10 wk）雄性WT小鼠和雄性D1（-/-）小鼠，并分为WT对照组及D1（-/-）组，每组各10只，饲养于SPF环境. 定期定时双盲观察两组小鼠的旷场试验、爬竿试验、平衡木试验和转棒试验以及日常的理毛运动、传代情况等，定期称体质量.
　　1.2.2免疫组化小鼠脑标本的制备小鼠行腹腔内注射戊巴比妥纳（30 mg／kg)进行麻醉，经左心室、升主动脉插管先快速灌注37℃生理盐水15 mL，再在20 min内灌注室温的40 mL/L多聚甲醛50 mL，先快后慢. 以上下丘为界做冠状分割，分别取出纹状体、中脑黑质节段，并后固定于上述固定液中，置于室温24 h后梯度脱水、透明、石蜡包埋以及连续冠状切片(片厚2 μm).
　　1.2.3TH免疫组织化学染色将切片入0.1 mol／L PBS漂洗后，0.5 mL/L h3O2处理，漂洗3次，50％正常羊血清封闭，兔抗小鼠TH多克隆抗体(1∶100)，4℃孵育过夜，漂洗3次；人生物素化羊抗免IgG(1∶100)室温孵育l h，漂洗3次，入ABC复合物(1∶100)室温孵育1 h，漂洗3次；DAB液显色，贴片，室温孵育30 min；平放切片并滴加苏木精，20 s后用自来水冲洗3 min，最后用双蒸水漂洗1次，风干后封片.
　　1.2.4Western Blot检测将两组小鼠颈椎脱臼处死，快速断头后于冰上操作，剪开颅骨，取出黑质及纹状体部位组织，每管加入800 μL RIPA液裂解后，快速冰上超声震荡，冰上搁置30 min，4℃， 10 000 g离心抽取上清液检测蛋白浓度，蛋白变性后进行检测.
　　1.2.5形态观察及细胞计数所选择的细胞计数位置相当于黑质嘴侧1／3～1/2区域的多巴胺能神经元，纹状体切片位置定位于上述相应细胞在纹状体的相应投射区，以TH阳性神经元解剖界限作为参照，根据Paxinos和Watson(1986)图谱，选择距前囟点一4.7 mm到一5.2mm之间区域作为阳性细胞计数区，于400倍光镜下计数. 对照小鼠脑立体定位图谱 ，各组每只小鼠选取大致相同部位的8张切片，将切片置于显微镜下，图像直接进入计算机，每张脑片分别在400倍以及200光镜下取两侧黑质及纹状体各10个视野. 每组观察6张切片，每张切片在光镜高倍镜下随机取3个4 mm的视野，用IMS彩色图像分析系统进行TH神经元计数.
　　统计学处理: 数据用x±s表示，结果统计使用t检验，P&<0.05有统计学意义.
　　2结果
　　2.1两组小鼠的行为学表现与WT组小鼠相比，D1（-/-）组在旷场试验、爬竿试验、平衡木实验及转棒试验中均表现出明显的行为功能障碍，其中旷场实验水平运动中，D1（-/-）小鼠跨越格栅的平均次数显著减少（P&<0.01），旷场实验垂直运动站立的平均次数也显著减少（P&<0.01）；爬竿试验中D1（-/-）小鼠的爬竿总时间及转身反应时间均明显延长（P&<0.05）；在平衡木试验中表现出明显的时间滞后（P&<0.05）；在特定时间内转棒次数明显减少（P&<0.05），较易从转棒机器上掉下. 与WT组小鼠比较，在饲养传代过程中， D1（-/-）小鼠表现出明显的理毛运动消失、饮食量减少、体格小、体质量轻，传代频率减少，每胎产出数量减少，胎鼠成活率低等生活质量下降表现.
　　2.2WT组和D1（-/-）组小鼠纹状体部HE切片两组小鼠纹状体部切片比较发现从大体形态上观察，两组小鼠尾状壳核（CPU）部神经团块正常，无差异表现(图1A，A′).
　　2.3两组小鼠中脑退行性神经元比较在D1（-/-）组小鼠的黑质致密部HE切片中形成嗜酸性小体，类似于临床帕金森病理改变中的路易氏小体，表明在D1（-/-）小鼠脑中神经元发生退行性改变，而WT组未发现类似变化(图1B，B′).
　　2.4两组小鼠中脑黑质嘴侧1／3～2/3区域多巴胺能神经元免疫组化染色阳性细胞为多巴胺能神经元. 经统计学处理，两组的该部位TH阳性神经元的数目差异不明显，两组小鼠中脑黑质嘴侧1／3～2/3区域多巴胺能神经元数目差异不明显(图1C，C′).
　　2.5WT组和D1（-/-）组小鼠纹状体部TH蛋白表达Western BlotWT组和D1（-/-）组小鼠纹状体部TH蛋白表达量不一致，D1（-/-）组TH的表达水平低于WT组小鼠，每组小鼠各取五只，提取纹状体部蛋白后，Western Blot统计结果显示D1（-/-）组小鼠纹状体部TH蛋白表达量明显少于WT组（P&<0.05，图2）.A，B，C：WT鼠；A′，B′，C′：D1（-/-）鼠.
　　3讨论
　　多巴胺受体在运动协调方面的研究近年成为热点，目前已分离出Dl-5五种亚型［5］. 我们重点研究D1受体在运动调节等方面的作用. 实验观察到，与WT组小鼠比较，D1（-/-）小鼠在运动协调等方面出现异常表现，且在两组小鼠饲养传代过程中， D1（-/-）组伴有理毛运动消失、饮食量少、体格小、体质量轻等生活质量下降表现.

　　酪氨酸羟化酶(TH)是DA能神经元合成的限速酶［6］，通过检测TH阳性细胞数目及TH蛋白表达情况可反映多巴胺神经元功能状态. 实验观察到，在HE染色形态学观察中，两组小鼠纹状体解剖形态表现及中脑黑质嘴侧1／3～2/3TH免疫组化多巴胺能神经元数目均无明显差异，此点不同于临床PD. 但是，实验观察到与PD类似的表现：D1（-/-）组在旷场试验、爬竿试验、平衡木实验以及转棒试验中的运动协调表现均明显弱于WT组，类似于PD患者的运动协调障碍. 但因啮齿类动物与人种属差别，致相同解剖部位功能障碍，但运动行为具体表现不同，本试验以旷场试验，爬竿试验，平衡木试验和转棒试验为检测指标，观察分析知，D1（-/-）组上述各指标均异常. 已知多巴胺能神经元退行性改变是PD患者脑部病理改变之一，本实验观察到，D1（-/-）小鼠中脑出现类似于PD患者中脑内路易氏小体的嗜酸性小体，且纹状体TH含量检测结果示，D1(-/-)组的表达明显低于WT组.
　　结合PD患者临床及病理表现分析认为，D1受体的缺失致小鼠运动协调障碍且伴体质量轻，体格小等特征［7-8］. 与PD患者表现及病理变化类似［9-10］的是，该受体的缺乏致多巴胺神经系统功能紊乱，黑质部神经元趋向退行改变，但损害程度弱于PD患者. 因多巴胺神经元的退行性改变，使纹状体部TH含量明显减少，即轴突物质转运改变，胞内TH以减少远端运输分布为代偿以保证胞体部TH含量，维持神经元多巴胺合成，此阶段类似于PD的早中期阶段. 基于此，可知D1受体在运动协调方面发挥着重要的作用，该受体缺失致小鼠出现类似于PD病程. 面对逐年增加的PD患者，实用有效的临床治疗手段却相对薄弱的严峻现状，该研究发现可为临床PD疾病治疗提供一个崭新的前景，如D1受体保护剂以及D1受体激动剂类新药的开发研制.
【

参考文献

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