本文是一篇药学论文，本研究从盐碱地中取土，并从中分离出574株耐盐碱菌株，其中解磷菌125株，溶磷细菌147株，解硅酸盐细菌177株，产IAA细菌146株。根据以上功能鉴定结果，筛选得到8株性状优良且不同种属的耐盐促生菌。
1 前言
1.1 盐碱地及其成因
1.1.1 盐碱地的分布及种类
盐碱地是指土壤中盐的含量超过植物正常生命活动所需要的盐的含量的土壤（Yadav et al., 2011），据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界约有9亿公顷盐碱地，约占世界农业用地面积的20%，并以每年约100万公顷的速度不断扩大。
我国虽然是世界农业大国，却有占地约1亿公顷的盐碱地，这占据了我国耕地总面积的10%。我国盐碱地不仅面积大还分布广泛（陈玉林，2011；赵英等，2022），主要分布在滨海盐碱地区、黄淮海平原半干旱半湿润盐碱地区、东北平原半干旱半湿润盐碱地区、西北半干旱盐碱地区、内陆流域干旱盐碱地区以及青藏高原高寒干旱盐碱地区6个地区（俞仁培等，1999），其中东北盐碱地区的松嫩平原已成为全球三大钠盐渍土分布最集中的地区之一（Wang et al., 2019），接近70%的土壤被盐碱侵蚀，并且以每年2%的比例不断扩大（Ma et al., 2015）。
我们通常将土壤中的盐分对植物的影响分为中性盐胁迫和碱性盐胁迫，但是实际情况往往是两种胁迫同时存在。形成盐碱地的主要阳离子有Na+、Ca2+、Mg2+和K+等离子，主要阴离子有Cl-、SO42-、HCO3-、CO32-和NO3-等离子，其中CO32-和NO3-是造成土壤碱化的主要原因。我国盐碱地面积广泛，影响盐碱地形成的因素复杂，不同地区盐碱地中盐类的种类及每种盐的含量都大不相同（Shi et al., 2005），如松嫩平原地区，土壤中含有大量的NaHCO3和Na2CO3，且盐碱地面积占到该地区耕地面积的70%以上（周道玮等，2011）；在西北地区，盐碱土主要以硫酸盐和氯化物盐两种盐形成的盐渍土为主（Nan et al., 2022），其中土壤中普遍含量最高盐类为MgSO4（王世林等，2019）；我省存在的盐碱土壤面积广大，并且以滨海盐碱地为主，由于靠近海洋，海水中的盐分向土壤中渗透，使土壤含有高浓度的NaCl等盐分，尤其在近海地区，盐含量甚至超过100 g/kg，对农业生产影响严重。
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1.2 土壤盐碱化对土壤生态的影响
1.2.1 土壤盐碱化对植物的影响
盐碱土壤中高浓度盐离子的存在会对植物生长造成不利影响。首先，盐碱土中盐离子的浓度高、土壤渗透压大，植物根系难以吸收土壤中的水分，植物呈现出生理脱水的状况，导致植物生长缓慢甚至死亡（Ahmed et al., 2014）。其次，大量的Na+和Ca2+的存在，还会对植物正常的光合作用产生不利影响（郭全恩，2010）。盐碱胁迫对植物光合作用的影响通常分为气孔限制和非气孔限制两种，气孔限制就是在盐碱条件下，植物的叶片会受到渗透压的影响，植物为了保持体内水分会通过关闭叶面的气孔以减弱蒸腾作用，但是这种渗透胁迫响应同时也减少了二氧化碳的吸入，抑制了光合作用，这种光合作用的抑制通常是短暂且可逆的；而非气孔限制通常是高盐碱环境破坏了植物的光合系统（PS Ⅱ反应中心），从而导致二氧化碳利用率不可逆的降低（Farquhar et al., 1982；王旭明等，2019；周贝宁等，2021）。
除了盐胁迫，盐碱地的碱胁迫同样会对植物的生长造成不利影响。土壤pH过高会使土壤中的金属离子向植物根际富集并直接破坏植物的根系，影响植物对速效磷、速效钾等营养物质以及Na+、K+、Cl-、NO3-和H2PO4-等无机离子的吸收，破坏组织中的离子平衡和pH稳态（Jia et al., 2020；Yang et al., 2007），使植物受到生理干旱和毒性离子双重伤害（Chen et al., 2009）。此外，pH过高还会造成土壤板结，降低土壤孔隙率和通气率，增强土壤的毛细管作用，多种不利因素的协同作用，使植物在盐碱地上生长发育尤为缓慢（Shi et al., 2005）。此外，HCO3-的存在还会抑制植物体内铁离子的运输及Fe3+的还原，导致植物叶片黄萎（Abadía et al., 1995）。碱胁迫除了破坏细胞内外Na+、K+、Ca2+等离子的转运动态平衡，还会破坏细胞内活性氧的动态平衡，使得细胞膜脂过氧化，破坏细胞膜结构，影响物质跨膜转运及信号传导（赵风斌等，2012）。在细胞膜过氧化过程中，会产生丙二醛等过氧化物，因此通常将植物体内丙二醛的含量作为植物所受破坏程度的重要标准（孙国荣等，2001）。
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2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验样品
本试验所用盐碱土壤样品取自山东省滨州市阳信县，按照轻度、中度、重度的土壤盐碱程度取土，并分别将其标记为YX1、YX2、YX3。试验所用油菜品种为青丰种业有限公司产品。
2.1.2 试验试剂 本试验所用主要试剂如表2-1所示
药学论文参考
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2.2 试验方法
2.2.1 耐盐菌的分离筛选
取不同盐碱程度的盐碱土壤样品各10 g，分别溶于装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，置于30℃、180 rpm摇床震荡培养30 min。将土壤悬液进行梯度稀释，并取10-3和10-4稀释梯度的样品各100 µL分别滴到含有10% NaCl的改良Gibbons培养基上（每个稀释梯度作三组平行）并涂布，置于30℃恒温培养箱中培养1-2天。等到平板上长出单菌落时，用牙签挑取单菌落到对应培养基上，用三区划线的方法进行分离纯化。
挑取平板上长出的单菌落，接种于含有5 mL LB液体培养基的试管中，放置于30℃恒温摇床，180 rpm过夜震荡培养至菌液浑浊。将菌液与80%甘油按照2：1的比例混匀于2 mL 菌种保藏管中，编号并放入-80℃冰箱中，以建立小型盐碱微生物菌种保藏库。
2.2.2 耐盐菌促生性状的鉴定
2.2.2.1 菌株解磷溶磷能力鉴定
将筛选得到的菌株用牙签点接于解磷、溶磷培养基平板上，30℃培养3-5天，观察对应菌株是否出现透明圈，若出现则测量透明圈与菌落直径之比并进行统计。
2.2.2.2 菌株解硅酸盐能力鉴定
将筛选得到的菌株用牙签点接于解硅酸盐培养基平板上，37℃培养5天，观察对应菌株是否出现油滴状菌圈，若出现则测量菌圈与菌落直径之比并进行统计。
2.2.2.3 菌株产IAA能力鉴定
挑取耐盐菌单菌落，接种于5 mL含有L-色氨酸的LB液体培养基中，30℃、180 rpm震荡培养4天。取50 µL菌悬液于白瓷版，并吸取50 µL浓度为50 mg/mL的IAA溶液作为对照，每个处理等比例加入Salkowski比色液混合，置于暗处显色30 min。取出后与对照对比，观察并记录颜色变化，若颜色变为粉红色，则证明有IAA产生。取变色的样品所对应的菌液2 mL，12000 rpm离心5 min，取上清加入等体积的Salkowski比色液，置于暗处显色30 min后，测定其530 nm吸光值。
分别配制浓度为10、20、30、40、50 μg/mL 的IAA标准溶液，各取2 mL分别加入等体积的Salkowski比色液，置于暗处显色30 min，测量不同浓度反应液的530 nm吸光值。以530 nm吸光值为横坐标，以IAA浓度为纵坐标绘IAA浓度制标准曲线。
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3 结果与分析 ................................ 22
3.1 耐盐菌的分离纯化与促生功能鉴定 ................ 22
3.1.1 耐盐菌的分离纯化 ................................ 22
3.1.2 耐盐菌促生功能鉴定 .................. 22
4 讨论 ........................... 56
4.1 耐盐促生菌的常见种类 ............ 56
4.2 耐盐促生菌对植物的促生功能 ...................................... 57
4.3 耐盐促生菌对解除植物盐碱胁迫的作用 ............................. 58
5 结论 ...................... 60
4 讨论
4.1 根际促生菌的常见种类 研究发现的常见的PGPR有的Pseudomonas（假单胞菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Enterobacter（肠杆菌属）和Burkholderia（伯克霍尔德菌属）、Trichoderma（木霉属）、Serratia（沙雷菌属）、Arthrobacter（节杆菌属）、Streptomyces（链霉菌属）及Microbacterium（微杆菌属）等（Hassan et al., 2018）。本研究筛选得到的23株促生功能较好的耐盐促生菌分布在Bacillus（芽孢杆菌属）、Corynebacterium（棒状杆菌属）、Brevibacterium（短杆菌属）、Psychrobacter（嗜冷杆菌属）、Oceanobacillus（大洋芽孢杆菌属）五个属；在排除种间冗余菌株后，最终选定8株促生效果较好的菌株进行进一步菌种鉴定，鉴定结果显示，1-39为Priestia megaterium（巨大普里斯特氏菌）、2-52为Priestia aryabhattai（阿氏普里斯特氏菌）、2-175为Bacillus zanthoxyli（花椒芽孢杆菌）、3-30为Glutamicibacter endophyticus（内生谷氨酸杆菌）、3-43、3-110为Brevibacterium frigoritolerans（耐寒短杆菌）、3-117为Psychrobacter alimentarius（消化嗜冷杆菌）、3-120与Oceanobacillus profundus（深海芽孢杆菌）。
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在对菌种鉴定结果进行分析时发现，YX1号土壤和YX2号土壤中筛选得到的耐盐促生菌均属于芽孢杆菌属，微生物种类单一，而YX3号土壤中筛选得到的细菌种类却有多样性的特点。这可能是由于YX1和YX2号土为农田土样，YX3号土为荒地土样，农田土壤中微生物的多样性在大量施加化肥及农药的影响下明显降低（Cherif et al., 2009；霍晓非等，2008）。由此也能看出，提高农田土壤中微生物的多样性已经成为保护农田土壤环境的重要问题。多项研究表明微生物肥料能够增加土壤菌群多样性，有效改善土壤生态环境，在治理受污染土地及促进植物生长上有极大的应用前景（Ma et al., 2011；Rajkumar et al., 2012；李颖等，2014）。
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5 结论
本研究从盐碱土中分离得到具有良好促生功能的细菌，并对其进行菌种鉴定。根据耐盐促生菌对油菜的促生效果，配制复合菌剂，通过盆栽试验验证复合菌剂的应用潜力，并对其进行培养基及发酵条件的优化，主要得出以下结论：
（1）本研究从盐碱地中取土，并从中分离出574株耐盐碱菌株，其中解磷菌125株，溶磷细菌147株，解硅酸盐细菌177株，产IAA细菌146株。根据以上功能鉴定结果，筛选得到8株性状优良且不同种属的耐盐促生菌。
（2）结合菌落及细胞形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果确定，1-39为巨大普里斯特氏菌、2-52为阿氏普里斯特氏菌、2-175为花椒芽孢杆菌、3-30为内生谷氨酸杆菌、3-43、3-110为耐寒短杆菌、3-117为消化嗜冷杆菌、3-120为深海芽孢杆菌。
（3）本研究排除了对部分菌株有抑制效果的3-110号菌株，将其他7株耐盐促生菌用于盆栽试验。根据耐盐促生菌对油菜农艺性状、土壤酶活以及叶片生理生化指标测定结果配制了F01、F02和F03三种复合菌剂，并且复合菌盆栽试验结果显示，三种复合菌剂均在不同程度上优于单一菌处理，并且以1-39、3-30和3-117号菌株为组成的复合菌剂F01的促生效果最好。
（4）对组成复合菌剂F01的三株单一菌的培养基及发酵条件进行优化，初步确定1-39、3-30和3-117号菌株最适发酵条件和最优培养基配方，发酵产量较优化前分别提高195.55%、56.33%和83.86%。
参考文献（略）