本文是一篇医学论文，本研究发现 TLR4/Myd88/NF-κB 通路可能在调节巨噬细胞和心肌细胞的分子机制中发挥双重交互作用。一方面 Klotho 通过下调 TLR4/Myd88/NF-κB 通路降低整个心脏组织的炎症水平，包括心肌细胞和巨噬细胞。
研究内容与方法
1 实验材料
1.1 实验动物与细胞
（1） 本研究体外实验所用 RAW264.7 小鼠巨噬细胞株及 MCM 小鼠心肌细胞株来源于普诺赛生物科技有限公司。细胞培养条件为：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37 ℃，培养箱湿度为 70%-80%。RAW264.7 细胞生长培养基为小鼠巨噬细胞完全培养基，MCM 细胞生长培养基条件为：高糖 DMEM+10% 胎牛血清+1% 青链霉素混合液。
（2） 本研究在体实验所用小鼠为 SPF 级 8 月龄雄性 BALB/c 小鼠，由新疆医科大学动物实验中心提供。动物实验期间小鼠在新疆医科大学动物实验中心 SPF 级饲养室饲养，定期更换垫料，水源及饲料，每日定时给予适当光照模拟正常昼夜。 所有实验小鼠及操作均符合《新疆医科大学实验动物伦理委员会》。
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2 实验内容与方法
2.1 模型建立及分组
2.1.1 动物模型建立及分组
本研究选取 60 只 8 月龄雄性 SPF 级 BALB/c 小鼠。适应性喂养 1 W 后随机分为 4 组，每组 15 只：
（1） Adult 组：颈背部皮下及腹腔注射生理盐水；
（2） Adult+Klotho 组：颈背部皮下注射生理盐水，第 9 周开始腹腔注射小鼠重组Klotho蛋白（100 μg/kg/d，14 d）[24];
（3） Aged 组：颈背部皮下注射D-半乳糖（D-galactose，D-gal）（40 mg/kg/d，10 W）[25]，腹腔注射生理盐水；
（4） Aged+Klotho 组：颈背部皮下注射（40 mg/kg/d，10 W）[25]，第 9 周开始腹腔注射小鼠重组 Klotho 蛋白（100 μg/kg/d，14 d）[24]。
2.1.2 细胞模型建立及分组
RAW264.7 细胞培养及分组：
（1） 对照组：小鼠巨噬细胞完全培养基培养；
（2） Klotho组：小鼠重组 Klotho 蛋白（2000 pmol/L）作用24 h[26]；
（3） 收集细胞上清：对照组记为 M；Klotho 组记为 KM。
MCM 细胞培养及分组：
（1） M组：M 培养上清作用 24 h；
（2） M+D-gal 组：M 培养上清及 D-半乳糖（10 mg/mL）共同作用 24 h；
（3） KM组：KM 培养上清作用 24 h；
（4） KM+D-gal 组：KM 培养上清及 D-半乳糖（10 mg/mL）共同作用 24 h。
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结果
1 在体实验研究 Klotho 对衰老心脏的影响
1.1 外周循环补充 Klotho 对小鼠心脏组织衰老情况的影响
1.1.1 Klotho 外周给药对各组小鼠心脏组织切片免疫荧光标记的 P53 和 P21 表达的影响
与 Adult 组小鼠相比，D-gal 诱导的 Aged 组小鼠心脏切片中免疫荧光标记的 衰老标记物 P53 和 P21 表达显著增加（P < 0.001）。与 Aged 组相比，外周循环中补充 Klotho 蛋白的 Aged 组小鼠心脏 P53 与P21 表达明显减少，差异具有统计学意义（P < 0.001）。见图 1。
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2 体外水平探究 Klotho 对 RAW264.7 细胞极化及 MCM 细胞衰老的影响
2.1 Klotho 对 M2a/M2c 巨噬细胞极化的影响
2.1.1 Klotho 对 RAW264.7 细胞CD206，IL-10 和 TGF-β mR NA表达的影响
如图 12所示，与对照组相比，Klotho 处理组RAW264.7 小鼠巨噬细胞中 M2a/M2c巨噬细胞标志物 CD206 mRNA 表达上调（P < 0.01），IL-10 和 TGF-β mRNA表达显著上调（P < 0.001）。
2.1.2 Klotho 对 RAW264.7 细胞CD206、IL-10 和 TGF-β 水平的影响
相较于对照组，Klotho 处理的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞组CD206、IL-10 和 TGF-β 水平明显增加（P < 0.001），见图 13。
医学论文参考
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结果 ................................ 21
讨论 ........................................ 37
小结 ....................................... 40
讨论
近年来研究发现衰老是可逆转的，可以通过连体不同年龄动物模型改变血液成分、给老年动物注射年轻动物血液成分等方法来改善衰老动物的器官功能[33]。心脏衰老是一个复杂的过程，不仅涉及心肌细胞的分子机制的变化，还涉及巨噬细胞的分子机制的变化[34, 35]。动物外周循环系统伴随增龄发生巨大变化，导致慢性炎症水平升高及细胞间相互作用的失调[36]。这表明更换或补充血液中特定的循环因子，可以有效修复衰老引起的心脏功能与结构变化，延缓多种与衰老相关的心血管疾病。Klotho 是一种多功能抗衰老蛋白，可以作为体液因子参与外周循环。具有调节不同组织中巨噬细胞的极化状态的作用[22]。由此，在本研究中提出了一个科学假设，即通过补充外周循环中 Klotho 蛋白，衰老小鼠心脏的衰老可能会得到延缓。本研究发现在外周循环中补充 Klotho 可能通过调控巨噬细胞极化缓解心脏衰老。这一发现意义重大，心脏中存在一定数量的巨噬细胞，本研究的发现可能为了解心脏衰老的心肌细胞和巨噬细胞之间的分子机制指明了新的方向。此外，虽然 Klotho 并不在心脏中表达，但本研究证实 Klotho 作为体液因子参与血液循环并对远处器官产生影响。本研究表明外周循环中的 Klotho 对心脏衰老具有保护作用，可能为心脏衰老开辟了一种潜在的新的治疗方式。
自 1997 年以来，Klotho 基因已被确定参与抑制多种衰老表型[37]。Klotho 缺乏引起衰老表型，如肾功能衰竭、神经退行性变化、钙磷代谢紊乱，可能与 Klotho 的功能缺陷和随之而来的维生素 D 缺乏有关[38-40]。外周循环中 Klotho蛋白来源于肾小管和大脑脉络丛上皮细胞，具有心血管保护功能[41-43]。研究证实外周循环中 Klotho可能通过缓解氧化应激，炎症及纤维化发挥保护心脏的作用，缓解心脏的衰老[20, 21]。心脏内 Klotho 过表达减少了促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6、白细胞介素 12 和诱导型一氧化氮合酶的分泌[23]。衰老小鼠心脏内 Klotho 明显下调，氧化应激和炎症反应升高，导致心力衰竭的不良结局[23]。在慢性心衰大鼠心脏内过表Klotho可改善其心功能[19]。
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小结
1.动物实验：在D-半乳糖诱导的衰老小鼠中，外周循环补充 Klotho 蛋白可减轻衰老心脏的炎症和氧化应激，保护心脏功能，缓解心脏的衰老，其机制可能是Klotho 促进了心脏中 M2a/M2c 巨噬细胞极化。
2.细胞实验：小鼠重组 Klotho 蛋白通过促进 RAW264.7 小鼠巨噬细胞向 M2a/M2c极化延缓 MCM 小鼠心肌细胞的衰老。
参考文献（略）