本文是一篇医学论文，在本项研究中，设计的引物和探针只针对五种常见的病原菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌），而在五种常见的病原菌之外的致病菌却无法检测。
第一章 绪论
1.1 研究背景
FRI是骨折手术治疗中最具挑战性的并发症之一，给病患和社会带来了沉重的疾病负担和经济成本[1-3]。在闭合性骨折中FRI的发生率为1-2%，而在开放性骨折中其发生率可高达30%[1]。到目前为止，FRI的截肢率和复发率依旧很高[1,2]。一旦发生FRI，不仅会导致患者手术次数增加，抗菌疗程增长，骨愈合时间延长，还将严重影响患者身心健康[4-6]。除此之外，FRI患者的医疗费用是未感染患者的6.5倍[2,7]。因此，积极、有效地预防骨折术后感染，对骨折术后的良好预后至关重要。
1.1.1 病理学
FRI的病理变化是多因素造成的，其中细菌感染和骨折不稳定性是形成FRI的基础原因，且两者相互依存[8,9]。细菌生物膜的形成[10,11]、骨小管侵袭[12]、胞内感染[13]、葡萄球菌脓肿群落的形成[14]，是导致细菌生长与定植的主要原因。创伤处软组织的不稳定造成患者出现持续性创伤、新生血管受损及骨溶解，这些恶性循环为细菌创造了有利的生长环境，该环境可促进FRI的发展或阻碍FRI的根除[8]。
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1.2 FRI相关危险因素的危害
1.2.1 吸烟
研究显示，吸烟是导致FRI高发的一个独立的危险因素。吸烟或使用任意尼古丁都有增加骨折术后感染风险的可能。现有数据表明，停止使用烟草和尼古丁会降低骨折并发症发生的概率[17-19]。吸烟引起的氧化应激是导致感染的主要危险机制[20]，包括：（1）骨折处组织液和溶氧减少[21]；（2）免疫细胞杀菌功能受损[22]；（3）胶原合成与细胞修复功能衰减[23]，再加上吸烟者术后抵抗力的下降，使细菌更容易感染和传播。这些因素共同导致吸烟者伤口愈合缓慢，感染发生率升高。其次，当患者发生骨折时，骨折后的剧痛会显著抑制痰液通过咳嗽有效排出，进而抑制肺部分泌物的排出。吸烟可使患者肺脏功能下降，更易引起肺部感染，故而对有吸烟史的患者，术后伤口管理要比术前更为严格，以避免因患者及家属的失误而导致术后感染。
1.2.2 体重指数（BMI）
体重指数（body mass index，BMI）与骨折手术的感染密切相关。国内外研究表明[24,25]，BMI升高是术后感染的危险因素之一。肥胖或摄入过多的脂肪酸会导致免疫功能障碍。在动物实验中，有结果显示肥胖小鼠的胸腺、脾脏重量比正常小鼠轻，脾脏单核细胞、Th1阳性细胞数量显著减少，抗体依赖性和细胞毒性作用减低。不过，其IgM、IgG水平、NK细胞活性均高于正常鼠[26]。这提示人群中也具备类似的机制。当血清胆固醇和中性脂肪增加时，会引起免疫球蛋白的下降，进而导致免疫功能下降，影响对炎症感染的抵抗力。
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第二章 5种FRI常见病原菌MqPCR检测方法的建立
2.1 材料
2.1.1 菌株
大肠杆菌K12（ATCC25922）来自本实验室保留菌株，本研究所用其他四种菌株均购自中国科学院微生物菌种保藏中心，菌株信息见表2.1。
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2.2 方法
2.2.1 引物和探针的设计
查阅国内外相关文献发现，nuc基因编码金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶，是金葡萄球菌的高度保守序列[76-80]；表皮葡萄球菌16S基因，是该菌的保守序列[81,82]；外毒素 A 基因与铜绿假单胞菌致病性密切相关，是该菌最为重要的毒力基因[83,84]；大肠埃希菌ECs1048基因是其保守基因，存在于所有大肠埃希菌中[85]；外膜蛋白（OmpX ）是阴沟杆菌的毒力因子，可参与入侵[86,87]。这5个基因分别是5种致病菌的特异基因，从中选择保守序列设计引物及探针，使其退火温度相近，易于扩增且易于分辨与检测。根据Gene Bank中已发布的金黄色葡萄球菌nuc基因、表皮葡萄球菌16S基因、铜绿假单胞菌外毒素A基因、大肠埃希菌ECs1048基因和阴沟肠杆菌OmpX 基因序列，利用Beacon Designer 7分别设计一对特异性引物及其TaqMan探针，FAM 、HEX、CY5作为探针的发光基团，BHQ1、BHQ2为淬灭基团。为了检测方便，FAM标记金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，HEX标记表皮葡萄球菌和阴沟肠杆菌，CY5标记大肠杆菌。引物序列及扩增目的基因片段见表2.4，引物、探针由上海生工公司进行合成。
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第三章 MqP CR法检测FRI临床样本 ............................. 21
3.1 材料与方法........................................ 21
3.1.1 样本采集..................................... 21
3.1.2 纳入、排出标准.............................. 21
3.1.3 传统组织培养................................. 21
结论与展望.................................... 29
第三章 MqP CR法检测FRI临床样本
3.1 材料与方法
3.1.1 样本采集
本研究共收集了青海省人民医院90例骨折样本，其中66例为FRI样本，24例为阴性对照组，且患者骨折类型均为开放性骨折。在手术过程中，每位患者采集5份疑似感染区的组织样本（每份组织大小≦1cm3），采集后的样本直接收集到一次性无菌冻存管。其中，3份样本需及时规范送到检验科以进行细菌培养，1份样本提取DNA进行后续PCR操作，剩余1份-80 oC冰箱保存备用。若样本不能立即提取DNA，需将样本保存于-80 oC冰箱。保存期间反复冻融不超过3次，且标本运送应使用0 oC冷藏转运箱。术前采集血液样本，用于分析CRP和WBC。所有参与者都签署了知情同意书，本研究得到了青海省人民医院伦理委员会的批准（编号：2020-73）。
3.1.2 纳入、排出标准
根据国际专家组在2018年提出的标准[1]，参与者在以下情况中被确诊为患有FRI：（1）有瘘管、窦道或伤口破裂（与骨头或植入物相通）的出现；或（2）伤口有脓性引流或手术中出现脓液；或（3）至少有两次组织培养对同一病原体的存在检测为阳性。排除标准包括有关节假体的患者、非骨科植入物和数据不完整的患者。
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结论与展望
骨折相关感染（FRI）作为创伤性手术中常见的严重并发症[1]，临床发病率高，对患者术后恢复有很大影响。检测时间在FRI发病过程中非常重要[42]。快速、准确地对FRI进行微生物学检测，对抗菌治疗的成功至关重要。感染后若不及时准确地查明致病菌，进行治疗干预，易引发感染性骨不连和慢性骨髓炎，增加治疗的难度，截肢的可能性也将增大[98]。在临床上，组织培养被认为是FRI的确认标准[1,42]。但是，当需要检测一些生长较缓慢的病原体（如痤疮杆菌）时，组织培养法需要长达14天的时间才能得到结果[99,100]。这不仅增加了病人的医疗负担，漫长的检测时间也增加了细菌再次感染的风险[2]。
随着医学分子生物学的发展，PCR等分子检测方法被应用于骨相关感染的诊断和检测[62, 101-106]，且具有较好的优越性。但由于污染物的存在和微生物感染浓度较低等因素的影响，使得区分出真阳性和假阳性结果较为困难[107]。因此，需将这两种方法结合起来进行使用。对于FRI患者，可首次利用专门设计的MqP CR法，对大部分病原体进行筛查，获得准确且快速的初步结果。对于其余的阴性病例，则采用传统的组织培养法来做出最终诊断。
在本项研究中，设计的引物和探针只针对五种常见的病原菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌），而在五种常见的病原菌之外的致病菌却无法检测。这是导致监测范围有限，检测功效降低的主要原因。因此，在后续的工作中，本课题组将增加新的病原菌进行实验，进一步扩大检测范围，以提高Mq PCR法的检测性能。
参考文献（略）